TBA特异性荧光模式和亚细胞定位在中枢神经免疫疾病诊断中的重要性！
摘要 在过去十年中，自身抗体可导致大脑功能障碍这一认识，为神经系统疾病领域带来了范式转变，提供了重要的诊断和治疗新契机。针对神经元或神经胶质细胞靶点的特异性自身抗体的检测，让人们对中枢神经系统自身免疫有了更深入的理解，并对一些以往认为由 “感染性”、“特发性” 或“心因性”原因导致的疾病进行了重新分类。最突出的例子，如AQP4抗体，或脑炎中的NMDAR抗体，激发了整个临床和实验研究领域，对疾病机制…
摘要
在过去十年中，自身抗体可导致大脑功能障碍这一认识，为神经系统疾病领域带来了范式转变，提供了重要的诊断和治疗新契机。针对神经元或神经胶质细胞靶点的特异性自身抗体的检测，让人们对中枢神经系统自身免疫有了更深入的理解，并对一些以往认为由“感染性”、“特发性” 或“心因性”原因导致的疾病进行了重新分类。最突出的例子，如AQP4抗体，或脑炎中的NMDAR抗体，激发了整个临床和实验研究领域，对疾病机制和免疫异常展开探索。此外，这些发现也促使人们继续寻找更多自身抗体。本文以中枢神经系统自身抗体检测技术为核心，全面总结了CBA、TBA技术原理及其临床应用场景，同时，详细描述了TBA检测中神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等特异性荧光模式和亚细胞定位及其诊断价值。中枢神经系统不断扩大的自身抗体谱
CBA+TBA联合检测
目前中枢神经系统大多数自身抗体采用基于细胞底物的实验（cell based assay，CBA）检测特定已知抗体，并且在临床常规检测中已有商业化产品。在这种检测实验中，将HEK293细胞进行转染，使其表达具有天然构象的目标抗原，然后用荧光标记的二抗来观察抗体的结合情况（图1a、b）。在研究性实验室中，抗神经元自身抗体可以通过与培养的啮齿动物原代神经元结合来检测（图1c、d）。另外，对啮齿动物或猴脑组织切片进行间接免疫荧光检测（tissue based assay，TBA）能够发现新的自身抗体，染色模式和亚细胞定位有时能提示尚未明确的靶标。
图1 中枢神经系统疾病中自身抗体的诊断
a、b：基于细胞底物的实验（CBA）对特定的自身抗原具有高灵敏度。将LGI1抗原在HEK293细胞中表达，使用固定剂处理后，与含有自身抗体的患者样本孵育，再用荧光标记的二抗（绿色）进行可视化观察。c、d：使用相同的标记技术，将活神经元与患者样本孵育以检测自身抗体。放大的插图：结合在突触簇上的NMDAR抗体（绿色）。e - l：基于组织底物的实验（TBA），使用基于啮齿类动物脑组织切片检测自身抗体与神经元、神经胶质细胞的多种靶抗原表位的结合情况。示例包括NMDAR抗体（f）、GAD抗体（g）、Hu抗体（h）、Amphiphysin抗体（i）、Flotillin抗体（j）、GFAP抗体（k），一名对免疫治疗有反应的痴呆患者中，尚未明确抗原的自身抗体（l）
间接免疫荧光法（indirect immunofluorescence assay，IIF）：是用特异性抗体与相应抗原反应后，再用荧光素标记的第二抗体（抗抗体）与抗原-抗体复合物中第一抗体结合，洗涤后在荧光显微镜下观察特异性荧光。IIF根据抗原底物分为：基于细胞底物的实验（cell based assay，CBA）、基于组织底物的实验（tissue based assay，TBA）。相较于TBA，CBA具有较高的特异性和敏感性。
CBA：采用“表达神经细胞抗原的转染细胞”为抗原底物，针对特定已知抗体。主要用于抗神经细胞表面抗原抗体检测，神经细胞表面靶抗原通常由不连续表位的三级结构组成，这意味着保持天然抗原构象对于抗神经细胞表面抗原抗体的检测至关重要。相对而言，细胞内的靶点通常由更短的线性表位组成，主要采用CBA或免疫印迹法，但免疫印迹法带来的假阳性或假阴性问题不容忽视，因此必要时需结合临床并通过CBA或TBA予以验证。
TBA：采用“动物脑组织切片”为抗原底物，保留了动物脑组织天然广谱抗原。选用的组织来源可以为猴、大鼠、小鼠脑组织冰冻切片/石蜡切片，其中灵长类脑组织具有高度同源性，天然抗原谱最接近人类，但一般为商业化试剂盒；大鼠脑组织相对易获取，可制备新鲜冰冻组织切片，保证抗原稳定性。对于CBA不能确定的低滴度检测结果或罕见抗体，可采用TBA予以多方法联合确认。CBA是针对特定已知抗体的检测，不能识别未知抗体，而TBA根据荧光/组化模式有助于发现未知抗体。
CBA组合单一抗体的阳性比例较低，而囊括全部抗原的CBA组合也难以实现，这导致一些中枢神经系统疾病患者诊断延迟或漏诊，因此采用数种抗原的CBA组合联合TBA进行筛查，是一种推荐的可行方案。
TBA特异性荧光模式和亚细胞定位
TBA结果判读需要专业与经验积累，有条件的神经免疫中心与实验室保有TBA技术，有利于提高抗神经抗体的检测水平，也是探索新抗体与新的神经免疫疾病的重要条件之一。TBA结果判读可以根据中枢神经系统靶抗原进行组织定位、亚细胞定位。
TBA特异性荧光模式：1、神经元荧光模式：（1）神经元胞膜荧光模式：提示可能存在抗神经细胞表面抗原抗体，例如NMDAR抗体等；（2）神经元细胞质或细胞核阳性荧光信号提示可能存在抗神经细胞胞内抗原抗体，多数为副肿瘤抗体，例如Hu抗体等；（3）美杜莎头样荧光模式：针对小脑浦肯野细胞胞质、延伸至树突的选择性荧光信号提示可能存在小脑共济失调相关抗体，此类抗体不仅局限于小脑共济失调症状，例如Homer3抗体等；2、星形胶质细胞荧光模式：提示可能存在星形胶质细胞抗体，例如GFAP抗体等；3、少突胶质细胞荧光模式：提示可能存在少突胶质细胞抗体，例如MOG抗体等；TBA特异性荧光信号不限于上述类型，需结合具体荧光分布判断，尤其需要结合患者临床资料。抗核抗体、抗微血管抗体等非特异性荧光信号，往往没有特异临床指导意义。TBA有助于中枢神经免疫疾病诊断，同时，也可见于少数中枢神经系统感染等疾病。
Hippocampus 海马；cerebellum小脑图2 已识别和未识别抗原的神经元自身抗体的大鼠海马和小脑组织免疫荧光模式A1-A2：IgG与海马的分子层结合（箭头所示）、小脑的颗粒层结合（虚线箭头所示）；A3：CBA证实抗原为NMDARB1-B2：IgG与海马的分子层结合（箭头所示），在小脑主要与分子层（箭头所示）结合，但与颗粒层结合较弱（点箭头所示）；B3：CBA 证实抗原为LGI1C1- C2：IgG与海马的分子层结合（箭头所示），在小脑主要与分子层结合（箭头所示），与颗粒层结合较弱（虚线箭头所示）。C3：CBA证实抗原为GABARD1- D2：IgG与海马分子层结合（箭头所示）、小脑的颗粒层结合（箭头所示）；D3：CBA证实抗原为GAD65E：来自一名脑脊髓炎患者的未识别CSF -IgG与颗粒层的神经元表面结合（箭头所示）F：来自一名进行性脑白质病变患者的未识别CSF - IgG与颗粒层的神经元细胞质结合（箭头所示）G：来自一名GFAP星形细胞病患者的未识别CSF - IgG与海马齿状回的神经元细胞核结合（箭头所示）H：来自一名患有共济失调儿童的未识别CSF - IgG与小脑的浦肯野细胞结合（Yo抗体阴性）I1 和 I2 来自一名疑似副肿瘤综合征患者。未识别的CSF - IgG与小脑颗粒层、海马齿状回和锥体细胞的神经元细胞质结合（箭头所示）J：在一名脑炎患者中发现未识别的神经元细胞核IgGK：来自一名患有脑脊髓炎男子的未识别CSF - IgG与小脑的浦肯野细胞结合（Yo抗体阴性）（箭头所示）。他的脑脊液GFAP - IgG也呈阳性（虚线箭头所示）L - J：L 和 J 来自一名脑炎患者。未识别的CSF - IgG与海马齿状回的神经元胞膜（长箭头所示）和小脑颗粒层（虚线箭头所示）结合。似乎IgG也与海马锥体细胞的细胞质结合（短箭头所示）
图3 少突胶质细胞自身抗体的免疫荧光模式A1-A2：MOG-IgG在海马和小脑中的IF模式。A1：CSF-IgG与海马中的少突胶质细胞结合。A3：CBA证实抗原为MOG。B1-B2取自一名脑、脑干和脊髓有多发性病灶的患者。CSF-IgG与MBP表达部位结合。B3：CBA 证实抗原为MOG。
图4 美杜莎头样荧光IgG与大鼠小脑浦肯野细胞胞质结合（长箭头），选择性结合到小脑分子层的树突棘（短箭头）；CBA证实为Homer3抗体“美杜莎头样共济失调”：自身免疫性小脑共济失调中抗浦肯野细胞抗原抗体点击上方链接了解更多！参考文献[1] Prüss H. Autoantibodies in neurological disease. Nat Rev Immunol. 2021 Dec;21(12):798-813. doi: 10.1038/s41577-021-00543-w.[2] 关鸿志，崔丽英. 抗体相关的中枢神经系统自身免疫性疾病：探索与挑战. 中华神经科杂志，2019，52(02):81-84. DOI:10.3760/cma.j.issn.1006-7876.2019.02.001[3] 中华医学会神经病学分会神经感染性疾病与脑脊液细胞学学组. 中国自身免疫性脑炎诊治专家共识（2022年版）. 中华神经科杂志，2022，55(09):931-949. DOI:10.3760/cma.j.cn113694-20220219-00118[4] Gadoth A, Segal Y, Paran Y, et al. The importance of tissue-based assay in the diagnosis of autoimmune encephalitis. J Neurol. 2022 Jul;269(7):3588-3596. doi:10.1007/s00415-022-10973-8. [5] Gadoth A, Segal Y, Paran Y, et al. The importance of tissue-based assay in the diagnosis of autoimmune encephalitis. J Neurol. 2022 Jul;269(7):3588-3596. doi: 10.1007/s00415-022-10973-8. [6] Liu T, Chen B, Yang H, et al. Screening for autoantibodies in inflammatory neurological syndrome using fluorescence pattern in a tissue-based assay: Cerebrospinal fluid findings from 793 patients. Mult Scler Relat Disord. 2019 Feb;28:177-183. doi:10.1016/j.msard.2018.12.036.
