引言

肿瘤性小脑变性（PCD）是中枢神经系统最常见的副肿瘤综合征症状之一，PCD与靶向神经细胞内抗原（Hu、Yo、Ri、CV2/CRMP5），神经细胞表面抗原（Tr/DNER、mGluR1、VGCC）的多种自身抗体有关。然而，许多患者的免疫靶点仍未明确，导致诊断和治疗面临挑战。本文报道一例PCD合并肺鳞状细胞癌的患者，其体内存在新型神经元表面PRG5抗体。

胸部CT显示纵隔内肿瘤复发，脑部MRI检查结果正常。脑脊液（CSF）检查提示细胞增多（白细胞25个/mL）、蛋白升高（1.05g/L）、葡萄糖水平正常，细胞学检查结果无异常。所有经典副肿瘤抗体及已报道的表面抗体检测均为阴性。患者接受纵隔放射治疗后，其神经系统综合征趋于稳定，于发病4个月后死亡。

结果

大鼠脑组织切片免疫组织化学（IHC）检测显示，患者的血清和脑脊液可对大鼠小脑及海马神经毡进行染色，而对照血清和脑脊液无此染色效果（图1A）。患者的血清和脑脊液均能标记大鼠海马神经元的表面，并对树突棘的尖端进行染色（图1B）。采用患者血清和脑脊液对大鼠全脑组织裂解物进行免疫沉淀，随后进行质谱分析，我们鉴定出PRG5为靶抗原。PRG5是一种跨膜蛋白，富集于成年大脑的可塑性区域，参与神经突生长和树突棘形成过程。

为验证该抗原，我们采用基于细胞的检测方法（CBA），用患者的血清和脑脊液对PRG1、PRG3和PRG5进行检测。结果显示，两种样本均对PRG5表现出强反应性，对PRG1表现出弱反应性，而对PRG3无反应（图1C）。在非破膜处理条件下，PRG5也能被识别（图1D）。基于CBA的结果显示，抗PRG5抗体滴度＞1:200000（血清和脑脊液均为此滴度）。我们在214份患者血清（其中98例患有小脑共济失调、95例免疫组织化学检测显示神经毡染色阳性、21例为副肿瘤性小脑变性合并小细胞肺癌）和137份对照血清中，未发现其他抗PRG5抗体阳性的患者。

患者血清可识别PRG5上的构象表位，因其能从裂解物中免疫沉淀出PRG5，但在蛋白质印迹（Western blot）中，当PRG5变性后，患者血清便不再识别该表位（图1E、图e-1）。通过PRG3和PRG5的嵌合蛋白实验，我们将该表位定位至PRG5的第二和第三胞外环（图1F）。当使用去除了PRG1和PRG5 抗体的患者血清进行染色时，树突棘尖端的特异性标记会减弱（图1G、H）。

为研究抗PRG5抗体的作用，我们用纯化的健康对照IgG或患者IgG处理成熟培养的海马神经元，持续4天。结果显示，树突棘数量、树突棘形态、突触数量及树突分支均未发生变化（数据未展示）。然而，用患者IgG（而非健康对照IgG）处理海马神经元24小时后，会诱导绿色荧光蛋白（GFP）标记的PRG5发生内化（图1I）。内化的PRG5-GFP会在神经元胞体的EEA1阳性早期内体中聚集（图1J）。

(A) 成年大鼠小脑的免疫组织化学染色结果：上图为患者脑脊液染色，下图为对照脑脊液染色。患者脑脊液可染色小脑分子层的神经毡及浦肯野细胞胞质。比例尺：全景图100µm，放大图20µm。

(B) 培养大鼠海马神经元的免疫染色结果（体外培养18天）。

上图：使用患者脑脊液（绿色）和抗PSD95抗体（红色，用于标记突触后膜结构）进行破膜染色。患者脑脊液可标记成熟与未成熟树突棘的尖端。箭头所指处显示患者脑脊液信号与PSD95抗体在成熟树突棘尖端共定位。

下图：神经元表面与患者脑脊液孵育结合（绿色），随后进行破膜染色并使用抗MAP2抗体（红色，用于标记树突）。患者脑脊液识别出一个沿着树突分布的细胞外表位。比例尺：20µm。

(C) 表达PRG1、3或5并带有绿色荧光蛋白（GFP）标记的HeLa细胞（绿色）经破膜处理后，用患者或健康对照血清（红色）染色。患者血清强烈识别PRG5，对PRG1识别较弱。比例尺：10µm。

(D)表达PRG1或5并用带有绿色荧光蛋白（GFP）标记的HeLa细胞（非破膜处理）用患者血清（红色）染色。患者血清能强烈识别PRG5上的细胞外表位。比例尺：10µm。

(E) 使用患者或健康对照（HC）血清对GFP标记的PRG1、3、5进行免疫沉淀（IP）。样品经SDS-PAGE电泳后，用抗GFP抗体检测。患者血清可强力沉淀PRG5，对PRG1沉淀较弱。

(F) PRG5的结构示意图：在人胚肾细胞中表达GFP标记的嵌合蛋白（绿色）—— 该嵌合蛋白由PRG3和PRG5的结构域拼接而成，随后用患者血清（红色）孵育染色。结果显示，患者血清仅能识别嵌合体3，该嵌合体包含PRG5 的第二和第三胞外环。比例尺：10µm。

(G) 大鼠海马神经元（体外培养18天）经破膜处理后的免疫荧光染色：采用抗PSD95抗体（红色），以及去除PRG1和PRG5抗体的血清（绿色）或GFP对照血清（绿色）。若血清中去除PRG1抗体和PRG5抗体，则树突棘尖端（抗PSD95抗体是突触后膜的标志性蛋白，用来定位树突棘尖端）的特异性标记减弱。比例尺：5µm。

(H) 抗体去除效果的量化分析。柱状图显示每20µm树突上树突棘尖端的富集数量。每组样本数 N=18个细胞；误差线为平均值标准误（SEM）；p=0.0301（Mann-Whitney检验）。

(I) 转染PRG5-GFP的大鼠海马神经元（体外培养20天），用纯化的患者IgG或健康对照IgG（10 ng/mL）处理 24小时。细胞经酸洗涤以去除细胞表面所有蛋白后进行染色：用荧光标记显示人IgG（红色），并用抗EEA1抗体（蓝色，标记早期内体）染色。结果显示，患者IgG使PRG5-GFP从树突棘尖端内化至早期内体。箭头指示 PRG5-GFP（绿）、IgG（红）与 EEA1（蓝）的三重共定位。比例尺：5µm。

(J)海马神经元胞体中，含PRG5-GFP的EEA1阳性早期内体占比。每组N=17个细胞；误差线代表平均值标准误（SEM）；p=0.007（Mann-Whitney检验）。

讨论与结论

我们发现1例副肿瘤性小脑变性（PCD）患者，其体内存在针对PRG5蛋白细胞外构象表位的新型自身抗体。PRG5是一种神经元跨膜蛋白，在海马和小脑中表达，参与树突棘形成。该蛋白在小脑中的表达与患者表型相符。这一机制与抗NMDAR抗体的作用机制相似，经患者IgG处理后，PRG5会发生内化并在早期内体中聚集。由于PRG5在细胞膜上的定位对其发挥树突棘形成相关功能至关重要，因此其内化可能导致神经元功能障碍，进而引发神经症状。尽管目前仅发现1例PRG5抗体阳性的PCD患者，但我们仍建议临床医生关注该抗原，因为胞外抗体具有潜在致病性，且通过积极治疗可能使患者症状得到改善或稳定。

参考文献

van Coevorden-Hameete MH, de Graaff E, Titulaer MJ, et al. Plasticity-related gene 5: A novel surface autoantigen in paraneoplastic cerebellar degeneration. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 2015 Sep 24;2(5):e156.