Neurochondrin是自身免疫性小脑变性的神经元靶抗原

✦+ 点击上方蓝字关注我们目的报道一种新的神经元靶抗原在3例自身免疫性小脑变性患者中的应用。方法对3例亚急性至慢性小脑共济失调患者和对照组进行详细的临床和神经心理学评估，并进行定量高分辨率结构MRI检查。采用间接免疫荧光法和免疫印迹法对血清和脑脊液进行综合自身抗体筛查。使用海马和小脑裂解物的免疫沉淀结合质谱分析来鉴定自身抗原，通过在HEK293细胞中的重组表达和在几种免疫测定中的使用验证…

✦+

点击上方蓝字关注我们

目的

报道一种新的神经元靶抗原在3例自身免疫性小脑变性患者中的应用。

方法

对3例亚急性至慢性小脑共济失调患者和对照组进行详细的临床和神经心理学评估，并进行定量高分辨率结构MRI检查。采用间接免疫荧光法和免疫印迹法对血清和脑脊液进行综合自身抗体筛查。使用海马和小脑裂解物的免疫沉淀结合质谱分析来鉴定自身抗原，通过在HEK293细胞中的重组表达和在几种免疫测定中的使用验证了这一点。在外周血和CSF上进行多参数流式细胞术，并对外周血进行T细胞受体谱分型。

结果

患者表现为亚急性至慢性小脑和脑干综合征。MRI与随后的神经轴突变性相关的皮质和小脑灰质萎缩一致。IFA筛选显示，血清和CSF在海马和小脑分子层和颗粒层具有强烈的IgG1反应性，但不与30个重组表达的已建立的神经自身抗原结合。Neurochondrin（NCDN）随后被鉴定为靶抗原，用表达人Neurochondrin的HEK293细胞通过IFA和免疫印迹验证了重组Neurochondrin中和自身抗体的组织反应的能力。免疫表型显示，在疾病的急性期而非慢性期，鞘内B细胞和T细胞积聚和活化。T细胞受体谱分型提示抗原特异性T细胞反应伴随着抗Neurochondrin自身抗体的形成。在各种神经自身抗体相关神经综合征如复发缓解型多发性硬化、小脑多系统萎缩、遗传性小脑共济失调、其他神经系统疾病或健康对照组中未发现这种反应。

治疗
患者对之前的抗体消耗（静脉注射免疫球蛋白[IVIg]、免疫吸附、血浆置换）或短期免疫抑制治疗（环磷酰胺、利妥昔单抗、米托蒽醌）都没有表现出持续的反应。由于持续的临床进程，给患者1和2采用环磷酰胺脉冲疗法（每4-6周750-1000mg/ m2体表面积），进行了6-12个月的长期免疫抑制治疗。患者3继续使用硫唑嘌呤（150 mg/d）和反复静脉注射免疫球蛋白（0.4g/kg体重，每3个月连续5天）进行免疫治疗。在之后的6-12个月的临床随访中显示，实验组三名患者在各自的治疗方案（SARA评分：患者1为25/40，患者2为23/40，患者3为32/40）下病情稳定或改善，患者1和2病情进展完全停止，患者3持续稳定。患者自身抗体的特征分析患者血清和脑脊液的间接IFA使用脑组织的渗透性冰冻切片显示，与大鼠和灵长类动物小脑相比，大鼠海马区颗粒和分子层细颗粒状的IgG1染色更强（图1）。小鼠全脑的矢状位切片显示自身抗体反应性分布在大脑的所有部位（图e-5）。此外，灵长类动物下丘脑、大脑、脊髓和海马体也进行了类似染色。患者血清和脑脊液的滴度分别为1:320/1:32（患者1）、1:320/1:1 （患者2）、1:1000/1:32（患者3），经大鼠海马测定，患者1和3特异性抗体指数（AI）≥4，提示鞘内抗体合成。在患者的免疫抑制治疗期间滴度基本不变。然后用表达30种神经自身抗原的重组HEK293细胞进行进一步的单特异性分析：Hu、Yo、Ri、CV2、SOX1、PNMA1、PNMA2、ITPR1、Homer 3、CARP VIII、ARHGAP26、ZIC4、DNER/Tr、GAD65、GAD67、amphiphysin、recoverin、GABAB受体、甘氨酸受体、DPPX、谷氨酸受体（NMDA、AMPA、mGluR1、mGluR5）、LGI1、CASPR2、AQP4 （M1和M23）、MOG、ATP1A3，都没有显示出任何特定的反应。

Neurochondrin作为靶向神经元自身抗原的鉴定

使用患者血清对大鼠海马和小脑匀浆进行免疫沉淀实验，在SDS-PAGE凝胶电泳中观察到一个约75 kDa的蛋白质条带，如果匀浆与正常对照血清一同孵育，则不存在该条带（图2A）。通过基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪（MALDI-TOF MS），确定了75 kDa蛋白条带的成分为来自褐家鼠（Rattus norvegicus）的neurochondrin（UNIPROT acc. #O35095）。

免疫沉淀物的免疫印迹分析表明，患者血清中的免疫沉淀物在75 kDa处与兔Neurochondrin抗体发生强烈反应（图2B）。当用于IFA时，兔抗Neurochondrin抗体在大鼠海马区产生与患者血清荧光模式相匹配的荧光模式（图3A）。在海马IFA中，患者血清和兔抗Neurochondrin抗体均显示出对神经元细胞体、细胞质的主要反应性，但是神经轴突染色的程度较弱（图3B）。

为了验证抗原鉴定的准确性，使用表达Neurochondrin的转染HEK293细胞对实验样本进行了IFA检测（见图4A）。结果显示，所有患者的血清和脑脊液均与表达Neurochondrin的细胞呈阳性反应，终点滴度比组织上高10倍，抗体亚类为IgG1。在使用HEK293-Neurochondrin裂解物进行的免疫印迹法中，所有样本也与重组Neurochondrin呈阳性反应。相比之下，模拟转染的细胞没有显示出特异性抗体结合。另外，患者1和3中使用HEK293-Neurochondrin进行的特异性抗体指数大于4。通过与含有Neurochondrin的HEK293裂解物预孵育，可以消除患者自身抗体在组织上的反应（见图4B）。

在几个对照组中未检测到抗Neurochondrin抗体对33例各种与神经自身抗体相关的累及小脑和脑干神经综合征患者（抗NMDAR抗体、抗Hu抗体、抗Yo抗体、抗Ri抗体、抗AQP4抗体、抗LGI1抗体、抗CASPR2抗体）、36例未经治疗的RRMS患者（大多为幕下病变）、20例MSA-c、35例遗传性小脑性共济失调、150例其他神经疾病患者和37例健康对照的血清进行IFA分析和HEK293-Neurochondrin平行检测，都没有检测到与实验组患者血清在大鼠脑组织上类似的免疫荧光反应。在表达Neurochondrin的HEK293细胞上进行测试时，均未出现阳性反应。但是也不能完全排除这些自身抗体除代表了小脑和脑干炎症或变性的非特异性继发性副现象之外有其他表现。

讨论

我们报道了3例自身免疫性小脑变性病例，与血清和脑脊液中存在高滴度的特异性抗Neurochondrin IgG1抗体有关。所有患者都有CSF慢性炎症变化，同时鞘内合成了抗Neurochondrin抗体。因此，我们的数据确定Neurochondrin是自身免疫性小脑变性细胞内神经元靶抗原，并提示伴随的抗原特异性T细胞反应是潜在的效应机制。因此，他们为免疫介导的小脑共济失调谱增加了另一个重要的疾病实体。

参考文献
Miske R, et al. Neurochondrin is a neuronal target antigen in autoimmune cerebellar degeneration. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 2016 Dec 5;4(1):e307.

✦+

HongWang

宏望医学| 客服电话 |400-8700-266

Neurochondrin是自身免疫性小脑变性的神经元靶抗原

Neurochondrin作为靶向神经元自身抗原的鉴定

相关阅读