摘要

MRD是儿童ALL的关键预后因素，但目前基于IG/TCR重排的金标准检测方法复杂，且对部分患者不适用。致癌性融合基因的基因组断裂点（GFBs）作为稳定且具有生物学意义的标志物，有望克服这些局限性并提升MRD评估准确性。本研究在403例已知或疑似存在融合基因的患者队列中，采用基于捕获技术的短读长NGS策略结合开源分析流程，成功在97%的病例中鉴定出患者特异性GFBs。基于GFBs的MRD检测（通过qPCR或ddPCR）展现出极高的特异性，且检测阈值更低，相较于IG/TCR检测方法具有更高的灵敏度。对104例不同儿童ALL融合亚型患者的纵向监测显示：在非BCR::ABL的ALL病例中，两种方法具有高度一致性；而在ETV6::RUNX1和MEF2D重排的ALL病例中则存在融合依赖性差异——前者因持续重排而IG/TCR追踪效果常欠理想，后者则因VDJ重组缺失导致追踪不可靠。总体而言，这项大规模研究证实GFBs是稳定且可临床应用的MRD标志物，可整合到临床诊疗策略中，但需在选择标志物和解读结果时充分考虑亚型特异性生物学特征。

引言

近几十年来，儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）治疗效果的显著提升，主要归功于MRD监测技术的广泛应用。目前MRD定量检测的金标准是通过qPCR检测患者V(D)J重组产生的特异性IG/TCR重排。国际联盟（如EuroMRD）已将这些检测方法标准化，并将其纳入现代ALL诊疗方案的风险分层体系。

患者与研究方法

结果

1.短读长捕获NGS技术能够可靠地识别基因组融合事件

• 集成四种算法（Genefuse、Factera、Lumpy和Breakdancer）进行分析，87%（352/403）的病例成功检测到预期融合及其互补序列。在其余39例算法检测失败的病例中，通过人工核查，成功识别出复杂的基因座融合事件如DUX4-r，整体融合事件识别比例提升至97%（391/403）。

• 断裂点分散于内含子区域，未发现热点区域或明显的V(D)J重组信号序列（RSS），表明断裂主要源于随机机制而非序列特异性易感性。在阴性ALL对照组中未检出任何融合事件。未能解析断裂点的病例（15/403）包括MEF2D、DUX4、TCF3、NUTM1及ABL2重排。其中11/15病例进行了长读长纳米孔测序，所有的融合均得到确认。

• 在三个案例中，由于融合结构复杂性，无法确定精确的连接序列：TCF3::IGH::PBX1、TCF3::mtDNA::MDB3::PBX1以及NUTM1(int2)::ins::NUTM1(int1)::ACIN1。另外两个患者—MEF2D::SS18和IGH ::DUX4——因覆盖读段不足而无法准确判定连接位点。在其余6个案例（3个ABL2和3个NUTM1）中，纳米孔测序检测到的断裂点位于检测panel目标区域之外，需要扩展设计区域。

• 在微量/降解样本（包括FFPE、脑脊液、骨髓涂片及外周血cfDNA等样本）中GFB捕获panel成功检测到了的断裂点。在原始细胞比例较低（≤20%，n=5）的样本中，检测结果依然稳定。

2.基于GFB的qPCR检测技术能够满足MRD的灵敏度与定量

• 针对167例ALL的每个融合断点都设计了患者特异性qPCR检测方案。其中164例（98%）扩增成功，3例失败均源于断点特异性问题：高度重复区域的IGH::DUX4和CRLF2::P2RY8，以及含有长poly-T序列的MEF2D::HNRNPUL1连接位点。

• 随后根据EuroMRD标准，评估了检测方法的灵敏度范围（SR）和定量范围（QR）。结果显示，98%的断点达到10^-4的SR阈值，65%的断点达到10^-4的QR阈值。

3.在ALL的MRD监测中，基因组融合检测法优于IG/TCR检测法

• 进一步通过分析104例ALL患者的随访样本（同时采用GFB和IG/TCR两种方法），比较了GFB与IG/TCR检测法在MRD监测中的性能。98%和52%的IG/TCR标志物分别达到≤10^-4的SR和QR阈值。

• 与IG/TCR重排相比，GFB检测显示出相当的SR值（97% vs 98%≤10^-4），但QR值显著更高（68% vs 52% ≤10^-4；χ² p=0.021）。

• GFB与IG/TCR得出的MRD值显示出良好的线性相关性（R²=0.76），Ph+亚型的整体相关性极低（R²=0.24）。排除Ph+病例后，两种检测方法的一致性显著提高（R²=0.87）。

• GFB标记物表现出卓越的特异性：仅1/104的样本在1/6的重复中出现扩增（未影响SR与QR阈值）。215个IG/TCR标记中有92个（43%）在至少一次重复中出现扩增，占总重复数的21%。

• 在这92个非特异性重复中，10%的测量值处于1<ΔCt≤3区间，被视为“灰区”MRD，其结果需根据治疗阶段谨慎解读。而在34%的IG/TCR标记中，定义灵敏度极限的末端标准曲线稀释点位于该灰色区域。

• 许多IG/TCR检测限接近背景水平，这限制了定量深度（例如≤10^-4），增加了技术变异，并可能高估报告的灵敏度。而GFB标记物具有更高的特异性及更强的技术稳定性，能够在较低定量范围内实现稳定检测。

图2 GFB与IG/TCR重排作为MRD靶标的技术评估

4.GFB与IG/TCR检测结果一致性高

• 453对MRD检测结果中有342例（76%）在不同标志物类型间结果一致。在不一致的样本中，34例经IG/TCR检测处于灰色区域，但通过融合检测被重新判定为阳性（n=6）或阴性（n=28）；另有37例样本（来自26名患者）经IG/TCR检测呈低水平阳性（<10^-4），但融合检测结果为阴性；

• 11名患者的20份样本IG/TCR阴性，但融合阳性。鉴于基于融合检测的高特异性，假阳性可能性极低；反映了融合检测有更高的灵敏度，或者表明融合检测对白血病克隆的覆盖范围更为全面；

• 这两种标志物类型在这些样本中均实现了SR<10^-4，表明这些差异并非灵敏度导致，很可能源于基于GFB的检测方法具有更高的特异性（低假阳性率），以及在低原始细胞计数时存在的随机抽样变异；

• 当末端稀释度处于灰色区域时，IG/TCR检测的灵敏度可能被高估，从而加剧了结果差异。但总体而言，尽管有少量差异，但GFB-MRD检测方法与IG/TCR检测结果基本保持高度一致。

图3 GFB-MRD与IG/TCR-MRD结果的一致性及分类一致性

5.当IG/TCR-MRD功能受限时，GFB检测结果尤为突出

• 部分样本中GFB与IG/TCR-MRD检测结果不一致性，差异值超过1 log₁₀的标记组合，发现61例患者中有213份检测样本的MRD值存在差异；

• 技术因素是导致这些不一致性的主要原因（占82%），主要源于检测限附近的随机变异（<10^-4；涉及120份样本）或检测质量缺陷（34份样本；例如QR值≥5×10^-4）；

• 移植后或CAR-T细胞治疗后9例患者21份样本，尽管GFB检测结果为阴性，但其IG/TCR仍持续呈现低水平阳性，表明再生治疗背景下特异性不足导致了假阳性结果。

• 相比之下，9例患者的检测差异可归因于基础白血病生物学特性：第一是IG/TCR标记存在的广泛不稳定性——部分患者在复发时失去了诊断时的IG/TCR标记。第二是显著的IG/TCR寡克隆性，导致部分患者无法进行可靠的标记选择，因此导致检测方法间相关性较差；

图4 基于IG/TCR的MRD监测功能受限的临床场景

讨论

在ALL中监测初始致癌病变，为当基于IG/TCR的检测方法不可靠时提供了一种前景广阔的MRD检测替代方案。本研究提出了一种基于短读长捕获的技术方案，能够利用微量肿瘤DNA高效鉴定GFBs，从而推动基于GFB的MRD监测在ALL中的广泛应用。该流程采用开源融合检测工具，可轻松在具备高通量测序能力的诊断实验室中实施。在本研究队列中，该方法成功检出几乎所有预期靶点，并深化了对NUTM1、ABL2等近期已明确重排事件中断裂点分布的认知，为检测组合设计与检测方法开发提供了重要指导。

不同读长的测序手段可以进行互相补充。对于结构复杂的重排或高度重复区域，尤其是DUX4，短读长测序有时无法精确确定断裂点。这一局限性可通过高通量长读长平台克服。基于DNA的结构变异捕获技术拓宽了可进行全面表征和纵向监测的样本范围（如脑脊液、血涂片、FFPE组织或cfDNA）。GFB检测显示出极低的非特异性扩增和更少的模棱两可信号，而IG/TCR检测则常产生低水平背景信号。这种非特异性促使EuroMRD联盟为IG/TCR-MRD制定了更新版指南，引入了NGS或片段分析方法。凭借卓越的特异性，GFB-MRD能够从根本上消除更新指南试图解决的不确定性，并为处理此类病例提供了替代方案。

这种更高的分析特异性能够更精确地将MRD检测结果无法检测的患者归类至标准风险组，并降低了在细胞组成发生变化的关键时间点（如移植后或免疫治疗后）出现假阳性MRD结果的风险。基于GFB的MRD检测方法具有高特异性，只要分析足够的DNA样本，其灵敏度即可与基于IG/TCR的NGS检测方法相媲美。

在比较GFB与IG/TCR-MRD时，出现了不同的ALL亚型特异性模式。在Ph+ALL中，尽管在高疾病负荷时检测结果总体一致，在低MRD水平下会出现差异。将GFB检测与IG/TCR监测相结合可识别出此类Ph+ALL亚型，这对深入理解这一尚未完全阐明疾病的生物学特征及长期演变至关重要。在ETV6::RUNX1型ALL中，持续进行的寡克隆V(D)J重组导致免疫遗传学不稳定，大多数IG/TCR标志物无法全面反映白血病克隆的全貌，导致MRD检测结果被低估，且复发时标志物频繁丢失。相比之下，GFB标志物保持稳定，能更准确地反映疾病进程。MEF2D-r亚型呈现B细胞定向表型，但诊断时明显的寡克隆性往往阻碍了稳定IG/TCR标志物的选择，导致随访期间检测结果一致性降低。在相当一部分MEF2D-r患者中，基线时选定的IG/TCR标志物在复发时丢失，而MEF2D重排在整个病程中保持稳定，因此将MRD检测锚定于早期致病事件至关重要。相反，在ZNF384-r ALL中，IG/TCR靶点表现稳定且呈克隆性，与GFB标志物高度一致。从应用角度而言，全基因组测序技术在诊断领域的日益普及将加速患者特异性结构变异的发现，并扩展MRD检测靶点的范围。

ddPCR为GFB-MRD检测提供了互补方案。实验表明，GFB-ddPCR检测结果与qPCR高度一致，不仅能实现绝对定量（其标准曲线对原始细胞比例的依赖性更低），还具有更高的最低DNA检测量耐受性。

总之，GFB能以高特异性和稳定性将MRD定位至融合驱动型ALL的驱动事件。基于GFB的qPCR或ddPCR监测，可在疾病全程保持高度分析特异性和克隆稳定性，从而克服了基于IG/TCR监测的诸多局限。GFB检测可轻松整合到现有的NGS工作流程中。下游MRD监测在操作流程上与基于IG/TCR的标准方法完全一致，并符合EuroMRD指南建议，既避免了额外的技术负担，又充分利用了GFB靶标的生物学稳定性和单标记适用性。基于GFB的MRD监测是一种补充策略，可扩展当前的监测手段，尤其适用于寡克隆性、标记不稳定或细胞治疗后等复杂情况。尽管基于IG/TCR的MRD仍是标准实践的基石，但在特定亚组（尤其是携带KMT2A、MEF2D和ETV6::RUNX1基因重排的病例——这类病例占婴儿急性淋巴细胞白血病的80%及儿童BCP-ALL的25%-30%）中，一线采用GFB监测具有显著优势。随着全面基因组分析技术的广泛应用及EuroMRD指南的统一，基于GFB的方法将实现逐步且协调的整合。这些进展有望将GFB监测扩展至次级基因组改变及其他融合驱动型恶性肿瘤。然而，MRD靶标的筛选与解读必须考虑亚型特异性生物学特征和细胞起源，强调个体化评估的重要性。

Houtman, A.H., Arfeuille, C., Strullu, M. et al. Genomic fusion breakpoints for DNA-based measurable residual disease monitoring in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Leukemia (2026).