Blood Adv丨偶发性T细胞克隆的风险分层
摘要
由于T细胞肿瘤常表现为非特异性体征，因此在多种临床场景中均需进行T细胞克隆性评估，包括血细胞减少症、淋巴细胞增多症、嗜酸性粒细胞增多症及疑似淋巴瘤的诊疗流程。诸如TCR恒定区流式细胞术染色及基于分子技术的TCR克隆性检测等高灵敏度检测方法，虽提升了T细胞肿瘤的检出能力，但这些技术却常于无T细胞恶性肿瘤疑诊的患者中检出T细胞克隆。此类偶然检出的克隆（意义未明的T细胞克隆）并不必然具备进展为显性T细胞肿瘤的潜能，但可能引发不必要的诊断结论、造成患者无端焦虑，甚至不恰当的治疗干预。本文提出一套实用框架，用于对外周血中意外检出T细胞克隆进行风险分层，旨在最大限度降低不必要干预的风险，同时保持对真性T细胞恶性肿瘤的警惕性。
引言
T细胞肿瘤是一类具有异质性的疾病，其临床表现及预后各异。由于此类疾病常表现为非特异性临床症状，因此准确诊断需审慎整合临床、形态学、免疫表型及分子生物学数据。T细胞肿瘤的核心诊断特征为证实存在克隆性TCR基因重排，这反映了单一T细胞群体的扩增。克隆性检测技术的进步——尤其是基于分子生物学的检测方法以及流式细胞术对TCRβ链恒定区（TRBC1/2）表达的检测——已显著提升鉴定克隆性T细胞群体的灵敏度，如今这些技术正被临床医师与病理医师广泛应用于T细胞肿瘤的诊断与监测（图1框1）。尽管这些方法对于成熟T细胞肿瘤的诊断和监测至关重要，但其灵敏度的提高也导致在无T细胞恶性肿瘤临床病理特征的患者中频繁检测到T细胞克隆。这些T细胞克隆既不符合T细胞肿瘤的诊断标准，也不见于有T细胞肿瘤临床疑似症状的患者体内，但在接受血液淋巴系统肿瘤检查的患者中，其检出率高达26%，而在健康供体中，检出率则为13%。由于这些克隆不符合T细胞肿瘤的诊断标准，它们通常被标记为意义未明的T细胞克隆（TCUS）。然而，这一现象仍尚未被充分理解，关于报告、监测及管理的共识指南也尚未制定。因此，检测并报告此类意外出现的T细胞群体，可能导致不必要的诊断程序，引发患者不必要的焦虑，甚至在极少数情况下，导致不恰当的治疗干预。
图1 流式或分子手段检测T细胞克隆性的病理生理学机制
TCUS常与其他意义未明的克隆性淋巴细胞群进行比较，例如MBL和MGUS。有观点认为TCUS可能代表癌前病变或早期T细胞淋巴瘤，特别是与许多TCUS具有显著的免疫表型重叠的T-大颗粒淋巴细胞白血病（T-LGLL），并认为任何持续存在的T细胞克隆均属于癌前病变异常。但是目前尚无纵向研究证实TCUS可进展为T-LGLL。据估计健康人群中TCUS的患病率超过10%，而T-LGLL的发病率低于每年每百万人1例，理论上TCUS进展为T-LGLL的速率低于每100,000人1例，因此对每位TCUS患者进行密切监测缺乏充分依据。大多数TCUS的癌前病变潜力有限，有大量证据表明持续存在的克隆性T细胞群常由非肿瘤性机制产生。鉴于TCUS的患病率与已发表的T-LGLL发病率之间存在差异，亟需制定关于此类意外克隆的报告、监测及管理的指导原则。为了涵盖可能构成偶发T细胞克隆的每一种病理生理学机制，本文中TCUS定义为：通过流式细胞术或分子技术可检测到的任何T细胞克隆性，但其不符合T细胞肿瘤的诊断标准。本文探讨了可能产生可检测T细胞克隆的各种机制，并提供了一种风险分层策略，以帮助病理学家和临床医生识别、报告及处理偶发T细胞克隆的常见临床病理模式。
框1. T细胞克隆性的界定与检测 流式细胞术：目前已有检测TRBC1与TRBC2表达的商用检测试剂。通过TRBC1/2染色可借助流式细胞术检测克隆性T细胞群体。包含CD3、TCRγδ及TRBC1的流式细胞术检测组合即可用于评估T细胞克隆性。多项指南建议采用85%的阈值来界定T细胞克隆，即αβT细胞群体中TRBC1⁻或TRBC1⁺细胞比例＞85%。但各临床实验室对该阈值的应用存在差异：可采用批量设门策略或者与正常值差异门控策略，后者可更灵敏地检测T细胞克隆。在解读流式TRBC结果时需注意：①由于抗TRBC1/2抗体检测的是TCRβ链的恒定区，γδT细胞不表达TCRβ，所以不能评估γδT细胞的克隆性。②由于TCR复合物需要表面CD3的表达，因此丢失表面CD3的T细胞群体TRBC1和TRBC2呈阴性，无法通过表面TRBC评估克隆性。 分子技术：TCR基因重排可通过PCR或NGS在分子水平上评估。克隆性的判定阈值在不同平台和实验室间可能存在差异且具有主观性。TCR重排分析要注意无法确定T细胞克隆究竟对应αβTCR克隆还是γδT细胞克隆。此外，通过PCR或NGS法鉴定出的特定克隆序列，也无法与流式细胞术鉴定出的克隆群体明确关联。对T细胞克隆性的恰当解读，需要综合考量该克隆的相对及绝对丰度，以及免疫表型和临床数据。 |
非肿瘤性T细胞克隆性的免疫学机制
T细胞克隆可通过多种非肿瘤性机制产生。若此类现象是对特定抗原特异性激活的反应，则将这些克隆称为反应性克隆。任何降低T细胞受体库多样性的过程，均会增加鉴定到此类克隆的可能性。在不存在T细胞肿瘤病变的情况下，TCR库多样性降低常有两种机制：(1)免疫激活导致抗原特异性T细胞克隆增殖，许多病毒特异性T细胞克隆即使在没有持续感染或可检测到的病毒再激活的情况下仍可能持续存在，如EBV和CMV，特异性CD8+ T细胞克隆可占据TCR库的>30%。受宿主免疫状态影响的病毒特异性克隆长期存续，仅凭克隆性T细胞群体的持续存在，尚不足以判定该克隆具有恶性潜能。；(2)T细胞受体库总体规模的缩减（例如淋巴细胞减少症），常见于化疗的患者以及接受过移植的患者中。淋巴细胞减少症还会通过稳态增殖机制诱发代偿性克隆性T细胞扩增，使T细胞池的总规模维持在近乎恒定的水平。这些经稳态扩增的克隆可达到通过克隆性检测法检出的水平，从而在分子学或流式细胞术检测标准下模拟肿瘤性增殖现象。
通过上述机制生成的T细胞克隆本身并不具有恶性潜能，不应被视为癌前病变。需将TCUS与癌前血液淋巴系统疾病区分开来，例如MBL、MGUS以及CHIP均具有明确的恶性转化风险，因此需要报告并进行临床随访。
TCUS vs T-LGLL
反应性增殖的T细胞亚群最可能是高度抗原经历的效应记忆T细胞，尤其是具有细胞毒性表型的细胞。偶发的具有细胞毒表型的T细胞克隆与T-LGLL区分开来是长久的挑战，特别对于CD8+克隆群体尤为重要，因为有症状的T-LGLL通常为CD8+，而CD4+ T-LGLL通常呈惰性，极少需要治疗。将反应性大颗粒淋巴细胞（LGL）与T-LGLL区分开来的难点是：①T-LGLL常为偶然发现，可能仅表现为非特异性临床症状，如无法解释的血细胞减少。STAT3和STAT5B是T-LGLL的关键致病驱动因素，但仅约50%的患者可检测到这些突变；因此，未检测到这些突变并不排除诊断。②T-LGLL与非血液系统疾病密切相关，这些疾病也可能引发反应性细胞毒性T细胞扩增，如类风湿性关节炎和实体瘤。对于非血液系统疾病患者，反应性LGL扩增无法分辨血液肿瘤和反应性应答。此外HSCT后出现的短暂LGL扩增可能预示良好预后，这或许反映了GVL效应，而显著的抗原压力在极少数情况下也可能导致LGLL肿瘤形成如先天性免疫缺陷导致T-LGLL发病。③在STAT突变型LGLL的患者中，白血病与非白血病患者的TCR谱系存在重叠，提示持续的抗原刺激可能是驱动因素。
由于健康个体中的非肿瘤性T细胞克隆性常与T-LGLL具有相同的免疫表型特征，有研究证实尚无免疫表型特征可区分TCUS与LGLL。在此提出一个绝对计数阈值：外周血LGL细胞数<0.5×10³/μL或占淋巴细胞比例<20%时，该克隆极可能为非肿瘤性，无需进一步诊断检查。相较于仅依赖免疫表型特征，这一阈值在区分良恶性LGL表型T细胞克隆性具有更优的区分能力。本阈值建议用于外周血样本，而不是针对骨髓或组织样本的阈值。在缺乏T细胞肿瘤临床怀疑的情况下，该阈值可作为评估T细胞克隆的合理起点。
良恶性T细胞克隆临床病理特征
恶性病变的特征包括以下方面：(1)随时间推移克隆增大；(2)提示T细胞肿瘤的临床或形态学特征相关的克隆；(3)表现出与T细胞肿瘤更为特异的免疫表型异常的克隆，例如表面CD3或CD2的完全缺失，或CD10或CD30的异常表达。表面CD3表达的缺失是AITL、ALCL、淋巴细胞变异型HES、HSTCL及T-ALL等疾病的典型特征，这些疾病通常具有更强的侵袭性。若鉴定出独立的CD3− T细胞群体，则应进行全面的诊断评估。非LGL表型的CD4+CD8− T细胞克隆是可疑信号。经典T细胞抗原CD5或CD7的部分缺失在反应性LGL中较为常见，NK抗原CD16、CD56、CD94、NKG2受体或Kir的表达在反应性细胞毒性T细胞中十分常见，均不应视为恶性疾病的决定性证据。但是WHO第五版指南已将其中若干特征列为T-LGLL的诊断标准，这凸显了该领域诊断上的模糊性。
评估TCUS的方法
在图2中提出了关于外周血中检出的TCUS的报告建议，以及进一步的诊断检查和临床随访建议。偶发的T细胞克隆最初可通过流式或分子技术（包括PCR或NGS）检出。通过分子技术检出的任何T细胞克隆均应通过流式细胞术进行免疫表型分析（图2，框2）。保留表面CD3表达的αβ T细胞克隆应进行定量分析。建议对于无T细胞肿瘤临床或实验室证据的患者，可将针对T-LGLL设定的绝对计数阈值（<0.5×10³/μL或<20%淋巴细胞）应用于CD3+T细胞克隆。在此类情况下，不建议在诊断报告的首页列出此类克隆，因为它们很可能并非恶性或癌前病变，且列出此类克隆常会引发不必要的侵入性操作（如骨髓活检）。
对于超过此阈值的克隆或在对T细胞肿瘤有临床怀疑的患者中发现的克隆，需进行进一步检查。LGL-表型克隆若绝对计数低于每微升2000个细胞，且无持续不明原因的血细胞减少症（尤其是中性粒细胞减少症），则可视为低风险，仅需监测。除非流式或临床表现强烈提示存在明显或侵袭性T细胞肿瘤，否则建议先对外周血进行分子检测，而非立即进行骨髓活检。若发现与T细胞肿瘤相关的反复分子异常，则可进行骨髓活检及适当的影像学检查，以进行分期及完整的诊断评估。
框2. 双阴/阳T细胞群的临床与形态学关联。 双阳性：CD4/CD8双阳性是良性TCUS常见的免疫表型。CD4与CD8的紧密共表达，常为CD4dimCD8+或CD4+CD8dim。此类细胞群通常占淋巴细胞总数的<20%，且数量少于<0.5×10³/μL，在老年患者中较为常见；若双阳性T细胞克隆的数量超过上述阈值，或出现在对淋巴瘤或白血病有高度临床疑点的患者中，则应考虑T细胞肿瘤可能。任何T细胞肿瘤均可呈现双阳性免疫表型，最常见的类型是T-PLL和T-ALL，特征性形态学表现有助于鉴别诊断。 双阴性：双阴性（CD4-CD8-）克隆较为少见；需谨慎确认双阴性细胞群是否代表γδT细胞——根据定义，此类细胞不表达TRBC1/2。在适当的临床背景下，若发现双阴性αβT细胞克隆，应警惕自身免疫性淋巴增殖性疾病，如自身免疫性淋巴增殖综合征或Ras相关淋巴增殖性疾病。尽管这些疾病状态下的细胞扩增通常为多克隆性，但部分病例仍可能表现出受限的T细胞受体库。 |
图2 针对尚未确诊T细胞肿瘤患者外周血T细胞克隆性的检测算法。
病例分析
| 病例1 | |
| 病例描述 患者30+岁、无显著既往病史，出现持续血小板减少（108×10³/μL），轻度淋巴细胞减少，无其他血细胞减少症状和临床表现。 外周血流式检出两个异常T细胞群，均符合TRBC限制标准。计划进行骨髓活检排查T细胞淋巴瘤可能。再次进行外周血流式检测、NGS分析TCR重排、203基因panel检测。流式显示两个符合TRBC限制标准的细胞群：一个CD4+细胞群占淋巴细胞总数的12.2%（0.1×10³/μL；96%为TRBC1+），另一个CD8+细胞群占淋巴细胞总数的7.5%（0.06×10³/μL；TRBC1- 85%）。CD4+细胞群表达CD57，CD4dimCD7-、CD2微弱，符合LGL免疫表型。CD8+细胞群同样表现出与LGL免疫表型相符的特征。TCRβ呈克隆性（5.7%，主克隆）；TCRγ基因重排呈寡克隆性。外周血分子检测结果阴性。 | |
| 病例讨论 本例为无症状患者，T细胞淋巴瘤的临床怀疑较低，流式检测发现两个T细胞克隆，每个克隆占淋巴细胞比例均小于20%，丰度均低于0.5×10³/μL。根据本文标准符合TCUS，无需报告或进一步检查。本病例展示了寡克隆性T细胞扩增的常见模式，可能是由于淋巴细胞减少背景下的稳态增殖所致。流式显示有两个T细胞群符合限制性标准，两者均表现出效应记忆T细胞的免疫表型特征。CD8+细胞群勉强达到限制性阈值（85%），且免疫表型呈异质性；TCRβ基因重排研究结果则勉强达到本检测方法的克隆性阈值（5%）。CD4+克隆的免疫表型在临床实践中，对于伴有寡克隆性扩增的淋巴细胞减少患者极为常见。孤立性血小板减少症在TLGLL患者中并不常见。分子检测结果阴性进一步排除了血液肿瘤的可能性。 | |
| 诊断结论 T细胞无免疫表型异常。 | |
| 临床建议 建议进行常规临床随访。轻度血小板减少症可能为免疫性血小板减少症,若无症状且计数>100×10³/μL则无需干预。 | |
| 病例2 | |
| 病例描述 不足10岁的B淋巴细胞白血病患者，在维持化疗期间流式监测发现存在CD8+ T细胞克隆。WBC显示淋巴细胞减少（0.87×10³/μL）和血小板增多（462×10³/μL），其他实验室检查证实CMV感染活跃。除化疗恶心外无其他症状。 TCRβ和TCRγ重排阳性，主克隆占30%。进行了骨髓活检；外周血流式发现TRBC1限制性CD8+ T细胞群占淋巴细胞总数的27.7%，数量为0.24×10³/μL。表型CD5阴性，CD7弱表达，且均一性地表达CD56、CD57和单个Kir（CD158b）以及参与识别CMV感染细胞的NK细胞受体NKG2。此外还鉴定出一个NK细胞克隆均一性地表达单个Kir（CD158a）和NKG2C。 | |
| 病例讨论 患者T细胞克隆数量低于0.5×10³/μL，但占淋巴细胞总数的比例超过20%。该T细胞克隆为CD8+，并表现出活化LGL细胞的免疫表型特征。该克隆群体风险较低，建议通过定期WBC进行监测。 本病例展示了在病毒感染或再激活时可能发生的反应性克隆扩增的规模。该患者活动性CMV感染，该非典型细胞群体表达识别CMV感染细胞的受体NKG2C。同时还鉴定出一个NKG2C+NK细胞克隆，进一步支持这些群体的反应性性质。该细胞群体免疫表型显著异常，包括完全缺失CD5及均一表达CD56，是T-LGLL的典型标志，但也凸显了这些免疫表型特征在区分T-LGLL与良性T细胞克隆时的特异性较低。两月后随访患者仍无症状，WBC指标未见显著变化，流式显示T/NK细胞克隆群体数量均略有减少。这些特征说明应促使临床及实验室监测，而非采取有创性检查评估。 | |
| 诊断结论 T细胞未见诊断性异常。诊断说明：未发现血液淋巴系统肿瘤的形态学或免疫表型证据。患者在持续化疗期间出现CMV病毒血症及淋巴细胞减少症。再次检测到克隆性TRBC1dim CD8+ T细胞群，估计丰度为0.24×10³/μL。该克隆性T细胞群表达NKG2C，同时存在一个CD158a+b-e-限制性NK细胞克隆，亦表达NKG2C（0.05×10³/μL）。NKG2C是NK细胞受体，参与识别巨细胞病毒感染的细胞。鉴于这些细胞群及与CMV病毒血症相关的免疫表型绝对计数较低，这些细胞群极有可能是反应性克隆扩增。 | |
| 临床建议 进行常规临床随访及复查全血细胞计数。 | |
| 病例3 | |
| 病例描述 患者80+岁、患有Sézary综合征12年，此前曾经多线治疗，3年前最终使用帕博利珠单抗获得CR。此后一直无症状，未接受其T细胞淋巴瘤的治疗。 1年前监测外周血免疫表型显示存在非典型T细胞群，提示可能存在疾病残留/复发。TCRβ与TCRγ克隆性重排。在重新启动治疗前进行重复外周血流式分析显示，TRBC1+ T细胞群占淋巴细胞总数的7.5%（0.11×10³/μL），该细胞群呈CD4与CD8双阳性，并表现出CD7与CD26的异常缺失。 | |
| 病例讨论 已确诊T细胞淋巴瘤的患者，将免疫表型分析和克隆性检测结果与既往研究结果进行对比至关重要。既往检测结果显示，诊断时及接受9年治疗后，肿瘤细胞群的免疫表型与本次非典型细胞群均存在差异（图3H）。尽管肿瘤细胞群的免疫表型可能改变，但以下特征支持当前非典型细胞群与患者的T淋巴瘤无关：①CD4与部分CD8共表达在Sézary综合征/蕈样肉芽肿中较为罕见，且与侵袭性临床特征相关，这与本病例不符。该克隆的表型更符合CD4+CD8+双阳性TCUS型，在老年患者中较为常见。②TCR结果显示监测到的克隆序列与诊断时不匹配，提示该克隆与患者的T细胞淋巴瘤无关（图3G）。该克隆占比低于20%，丰度低于0.5×10³/μL，且是在一名对活动性T细胞肿瘤怀疑度较低的患者中鉴定出的；因此该克隆很可能为良性，无需启动进一步检查或治疗。由于TCUS在有蕈样肉芽肿/Sézary病史的患者中较为常见，本病例强调，对于有T细胞淋巴瘤病史的无症状患者，若发现新的主要克隆序列或显著的免疫表型改变，在调整治疗方案前应谨慎行事。 | |
| 诊断结论 T细胞未见诊断性异常。诊断说明：流式显示非典型T细胞群，免疫表型与患者先前报告的T细胞淋巴瘤不同。同期进行的NGS发现一个克隆，在诊断标本中非主要克隆。尽管无法完全排除这一细胞群代表T细胞肿瘤的一个亚克隆的可能性，但更倾向于认为该细胞群代表一个无关的反应性克隆扩增。 | |
| 临床建议建议进行常规临床随访 |
图3 三例偶发T细胞克隆病例。（A-B）病例1。（C-D）病例2。（E-H）病例3。(G)克隆性TCR序列的纵向分析。(H)诊断时的免疫表型异常与当前标本中非典型T细胞群体的免疫表型对比。
结论
随着灵敏的T细胞克隆性检测方法的广泛应用，包括使用NGS进行的TCR重排研究以及针对TRBC1/2的流式细胞术染色，目前已能够更好地检测T细胞肿瘤，同时还能在健康个体中发现广泛的良性T细胞克隆。这些克隆通常由感染或稳态增殖产生，一般不具备恶性或癌前病变潜能。对这些病变的准确诊断需要综合考量免疫表型特征、克隆大小及临床背景。仍需开展大量研究，特别是结合分子生物学研究与临床结局的纵向研究，以确立基于证据的判定标准，从而可靠地区分良性克隆性与早期T细胞肿瘤。尽管仍在等待此类共识标准的制定，但本文提出的框架为解读T细胞克隆性提供了一种实用且保守的方法，既能减少过度诊断和不必要的干预，又能对真正的T细胞恶性肿瘤保持适当的敏感性。
参考文献A. J. Wilk, et al. A practical approach to risk stratification of incidental T-cell clonality.Blood Adv (2026) 10 (18): 6134–6144.
