过去20年间，临床诊断性基因组检测方法的使用日益广泛，我们对现有疾病的临床表型、遗传图谱、遗传模式都能够有更深入的理解。这些进展为人类疾病的病理生物学机制和遗传致病机制提供了重要见解，开启了分子医学的新纪元。本综述旨在帮助血液科医务人员理解：如何结合其他可用信息，以及与血液科相关的不断发展的遗传概念和模式，构建并制定基因组学工具的合理使用与解读策略。

学习目标

• 熟悉与血液系统疾病相关的遗传模式和机制，以及这些模式和机制如何影响诊断检测策略；

• 熟悉目前常用的基因检测与分析方法，包括其相关局限性和潜在问题；

• 熟悉标准临床基因检测流程，包括检测后结果评估与咨询。
  

37岁男性患者，淋巴结和脾脏肿大并持续加重，被转诊至血液/免疫遗传学诊所，以评估是否患有自身免疫性淋巴增殖综合征（ALPS）。病史：自幼反复出现口腔阿弗他溃疡、皮肤脓肿、鼻窦肺部感染，以及激素敏感性免疫性血细胞减少。此前，他因临床诊断为常见变异型免疫缺陷病，接受过免疫球蛋白替代治疗。血液科正在对其进行恶性肿瘤相关评估。家族史显示双亲家族均存在免疫介导疾病史。

免疫学检查：孤立性IgA缺乏症，其他免疫球蛋白水平正常；CD4+ T细胞比例处于临界升高水平，B细胞计数降低，NK细胞计数处于临界降低水平；血清/血浆细胞因子升高，提示适应性免疫激活（可溶性IL-2R、IL-10），并伴随Th1型炎症（CXCL9、IL-6、IL-18、IL-18BPA），可溶性FasL处于临界升高水平；维生素B12水平正常。全血流式细胞术显示，TCRα/β⁺双阴性T细胞轻度扩增。Fas介导的凋亡正常。影像学检查显示，多个部位存在18F-FDG高摄取性淋巴结肿大及骨髓摄取增高。

如同煤矿里的金丝雀一样，血液是基因驱动疾病病因潜在的早期预警信号，但是血液系统疾病的发病途径多样，这些病因并非都具有血细胞内在的异常（图1）。每种血细胞谱系都有其独特的相关遗传疾病和细胞表型图谱，因此需要理解其独特的遗传模式，并制定针对性的分子诊断方法。最后，鉴于髓系和淋系在原发性造血系统疾病中均广泛受累，现已明确，血细胞减少等表型可能与同一疾病中的多种机制相关。

图1. 血液异常的多种病理生物学机制。除造血细胞自身缺陷外，血液异常可能由多种因素导致。这些异常可能是其他器官功能障碍的继发表现，也可能是代谢或免疫/炎症介导的系统性缺陷所致。多种病理过程可能同时发生，并影响外周血和骨髓细胞。

分子遗传学检测已变得日益经济高效且临床应用广泛，但它仅是众多有助于诊断和鉴定疑似基因驱动疾病的检测方法之一。NGS技术的广泛应用，从临床、细胞和分子多个层面拓展了我们对人类疾病的认知。我们对造血系统疾病潜在遗传结构和机制模式的深入理解，不仅推动了个性化医疗的发展，也对传统人类遗传疾病认知提出了挑战。

血液与免疫疾病遗传评估的模式与挑战

实际上，分子诊断策略的选择需综合考量诸多因素，包括但不限于遗传差异及其相关基因组结构，以及现有分子检测方法与分析工具（图2）。我们重点关注基于DNA的分子诊断，同时也认同其他类型分子检测方法的存在。

图2. 分子诊断测试策略的考虑因素。

人类遗传病表现的异质性并非新概念，但遗传驱动的血液与免疫疾病（GBIs）的多层次异质性尤为显著。与其他孟德尔遗传病不同，表型变异和不完全外显在GBIs中较为常见，而非特例。完全不相关的疾病分子机制可能导致极为相似的临床表现，而即使在近亲家庭成员中，相同等位基因也可能导致截然不同的临床和/或细胞学结局。这些异质性源于多种机制，它们在患者基因型层面及更高层面影响疾病表现。此外，单个基因通常可能涉及多种致病机制，甚至同一机制也可能导致多种临床表现。然而目前明确的基因型-表型对应关系仍较少（典型例子为：ADA2突变可导致血管炎或纯红再障）。

例如前文所述案例中的患者最终被诊断为NFKB1缺陷症，这是常见可变免疫缺陷和免疫细胞减少症最常见的单基因病因之一。但这种GBI也可能表现出其他多种临床表现组合，从免疫缺陷到免疫调节异常，再到自身/过度炎症反应及恶性肿瘤风险增加，这些表现均可能引发血液系统异常。

获取细胞和分子表型临床数据的能力，是GBIs相较于其他类型遗传病的独特优势。这些数据既可为基因检测策略提供依据，也为检测后对已识别变异的评估提供参考。因此，对初诊患者进行免疫表型分析，并了解特定疾病内表型相关的免疫和血液诊断研究的解读局限性与假设具有重要价值。在本例患者中，由于TCRα/β⁺双阴性T细胞扩增并非单基因ALPS的特异性表现，我们建议在ALPS panel以外开展更广泛的检测。

最后，明确的恶性肿瘤以外的致病性体细胞变异为诊断和咨询增加了额外的复杂性（表1）。就本例患者而言，若在常规胚系检测中未发现致病变异，本应考虑进行更深入的体细胞测序以排查潜在的体细胞嵌合体病因，特别是考虑到有研究报道，在上述高度怀疑的大部分通路相关基因中，均存在体细胞嵌合现象。

表1. 已知体细胞嵌合现象相关的遗传性血液和免疫疾病

体细胞改变可直接模拟或恢复生殖细胞疾病表型，也可间接导致不完全外显和表型变异。部分GBIs（如VEXAS综合征）完全由谱系特异的体细胞突变驱动，这类突变可为某一细胞亚群赋予增殖优势；而另一些GBIs则属于生殖细胞疾病，其嵌合现象可能源于原始突变导致的增殖劣势。逆转机制可能包括原始位点回复突变、基因内交叉、基因转换或补偿性拷贝数改变。这意味着，临床表型正常的家庭成员仍可能面临疾病表现风险，因此可能需要进行更深入的测序和额外组织取样，以明确嵌合现象的真实程度。相反，一些通常由重现性体细胞病变引起的疾病，也可能存在罕见的生殖细胞风险传递。

常用基因检测平台

部分常用基因检测平台如表2所示

染色体微阵列。目前，大多数商用染色体微阵列（CMA）使用等位基因特异性DNA探针，目标区域为个体间存在SNP变异的区域，以检测CNV。通常在基因富集区域，以及针对约10⁴碱基对及以上数量级的CNVs时检测结果更可靠。SNP芯片还可识别可能携带隐性致病性变异的纯合子区域（ROHs）。更大的CNVs和结构变异（SVs）（包括平衡易位/复杂重排）可能更适合通过核型分析来揭示，而更小的变异则可通过定制化生信策略从NGS数据中分析得出。总体而言，对于10²至10³碱基对数量级的CNVs，NGS平台的检测仍存在挑战。

高通量测序（NGS）。目前，临床级NGS以Illumina短读长测序仪为主导，广泛用于研究级和临床级靶向panel、全外显子组测序（WES）或全基因组测序（WGS）。不同检测的具体检测参数可能差异很大，因此仔细阅读详细说明至关重要。选择检测策略时的重要考量因素包括：明确检测鉴别诊断中位点所需的覆盖范围和深度、报告时间（TAT），以及该检测方法是否支持原始数据返回。

当怀疑存在嵌合现象时，可能需要更高的检测深度。例如，大多数靶向panel或WES通常可达到约10²×至10³×的检测深度，但对于WGS而言，由于测序位点覆盖范围更广，难以达到高深度检测。WES可检测到低至5%~10% VAF的变异，除非特别要求，否则不会自动检测位点是否为体细胞变异。相反，对于检测低丰度致病性变异，使用针对性的靶向panel可能是更佳策略。如需从背景体细胞变异中鉴别出真正与疾病相关的体细胞变异可能需要额外的变异检出和分析策略。

基因检测方法示例（表2）

单基因位点检测。位点特异性检测可能涉及多种检测方法，但如果根据临床表现、人群特征或其他检测结果高度怀疑特定疾病，该方法仍是合理的一线检测手段。对于具有高度序列同源性的位点（如CFH-CFHR）或已知重现性结构变异的位点（如F8），传统Sanger测序可能需结合其他检测方法，如MLPA或基于PCR的策略。

靶向基因panel。对于遗传鉴别诊断能力有限的特定临床疾病（如红细胞膜病），和/或特定位点需多种检测策略结合的情况（如aHUS），靶向基因panel仍是有效的一线检测方法。同名的靶向基因panel检测范围和检测能力可能差异很大。一些实验室所有靶向基因panel均基于NGS平台，仅针对指定基因集进行分析；有的实验室可能针对已知内含子（若基于WES）和/或结构变异提供互补检测。

表2. 常用遗传学诊断检测方法及其潜在临床应用示例

靶向基因panel与更其他广泛的检测相比，常被提及的优势包括意义未明变异（VUSs）或偶然发现可能更少。然而，由于基于靶向panel的分析未考虑患者的特定临床特征，且患者的血液系统表型可能继发于未被涵盖的其他病因，因此出现误导性VUSs的风险也同样存在。TAT也不尽相同，且并非总是比WES或WGS更快。此外，对于GBIs等基因图谱快速扩展的领域，若不频繁更新，靶向panel的效用会欠佳；但若频繁更新，则会变得与广泛的检测一样昂贵且繁琐。

外显子组和基因组测序。一线WES/WGS已被证明比其他方法能提高诊断率并降低成本（尤其是在可获取家系trio样本时），但并非在所有情况下都适用或可及。WES通常涵盖大部分编码外显子，以及长度不一的侧翼非编码序列；而WGS则针对未富集、无筛选的序列进行测序。WGS可减少偏向性，并确保对SV/CNV和非编码区检测的覆盖度更均一，但通常测序深度较低。

NGS工作流程概述

经过临床评估和知情同意咨询后，医务工作者选择检测样本类型举足轻重（图3）。在ASCT或克隆性恶性肿瘤情况下，获取非造血组织样本（如皮肤成纤维细胞）可能至关重要，因为即使是颊黏膜和唾液样本也并含白细胞。仅通过血液或骨髓样本的NGS检测，通常无法通过体细胞突变推断胚系变异状态，但如果在家庭成员中或患者的非造血组织中明确识别出相同变异，则可支持胚系变异的判断。

图3. NGS工作流程概述。

WGS可检出约500万个变异，WES可检出约10万个变异，随后需分析其致病性，这是限制TAT的主要瓶颈。2015年，美国医学遗传学会（ACMG）提出了一个目前广泛应用的标准来评估变异影响基因产物和/或功能的潜在可能性。这些标准涵盖与致病性相关的多种遗传概念和各类数据，通过整合这些信息，将每个变异从良性到致病性进行标准化分类，从而对变异的潜在分子影响形成共识。然而，有许多基于假设的标准如今已过时或并非在所有疾病领域均适用，因此仍在不断进行调整和完善。

重要的是，变异分级并不能解读为与患者临床情况的相关性——这仍是医务工作者的职责。一些致病性的变异可能临床影响很小或无临床影响，而另一些VUS的变异却可能是患者的致病原因，因此需要更多证据才能升级该VUS分类。额外的表型分析可能有助于确定与变异的相关性，或提示需深入研究特定的候选通路。

即使制定了基因特异性分级指南，ACMG的分级标准也未必总能符合医务人员的临床偏好或认知。例如，基于患者细胞的研究和体外研究，两者均有助于进一步明确VUS突变的意义，且从临床决策角度看，两者的信息价值可能被认为相同。然而，这两类数据对变异分类的影响可能不同：前者未能从患者基因组背景中提取目标变异，因此可能仅符合整体表型（PP4）标准；而后者作为满足PS3标准的功能性数据，可能具有更高权重。

若无法明确诊断，需记住：临床级基因分析仅能报告已知基因-疾病关联中的变异。此外，对于医务工作者未报告的表型，实验室无法知晓需关注哪些基因。不同实验室在处理VUS报告、新发现的基因-疾病关联、偶然发现以及家庭成员评估方面的方式也可能存在差异。

如果诊断明确，则可能需要通过持续的反向表型分析，更好地明确患者疾病的特定表型，为治疗提供依据。

最后，无论检测结果如何，检测后咨询都至关重要，有助于患者和医务人员就检测结果对患者自身护理及家庭成员的意义达成共识。在对上述案例患者进行的检测后咨询中，我们强调，其最终分子诊断并非排除了众多其他临床诊断，而是为这些临床诊断提供了根本解释。

当前诊断率有限的原因

目前，即使采用最先进的临床基因检测方法，仍有超过半数疑似基因驱动疾病的患者无法确诊。这反映了技术、分析及认知方面的局限性。

所有基因分析都遵循“垃圾进，垃圾出”的原则，检测结果的质量取决于所提供信息的准确性和完整性。在制定遗传鉴别诊断和进行标准基因分析时，目前仍高度依赖特征匹配（如人类表型数据库（HPO）术语），而实际上病理生物学匹配会更有效。因此医务工作者需考虑最可能需要研究的通路和过程，而非仅提供体征和症状清单。例如在上述案例中，淋巴增殖性疾病合并B细胞缺陷，同时存在无菌性炎症性皮肤病，这提示问题不仅限于适应性免疫调节异常。其血清细胞因子显示出Th1型炎症特征，涉及JAK-STAT和经典NF-κB信号通路，同时有其他促炎信号通路的轻微参与。这支持了需考虑Fas介导的凋亡通路以外的其他缺陷，最终使其被诊断为NFKB1缺陷症。

目前，我们的血液疾病致病位点目录不仅不完整，而且已知的遗传病中造血相关表型可能被低估和未充分表述。非单基因疾病结构、非孟德尔遗传模式、重复序列或同源序列富集区域，以及非编码区、结构和体细胞变异，均对当前临床检测和分析模式构成挑战。

为解决这些问题，新型技术不断涌现并快速投入临床应用。光学基因组图谱技术已用于癌症中复杂SV的检测，而长读长测序技术则能大范围地识别致病性病变、实现长距离基因分型、在复杂基因组环境中定位病变，并捕捉DNA甲基化等修饰核酸状态。然而由于分析这些新增信息维度需要更复杂的算法，数据存储和计算资源需求太高仍是阻碍其广泛应用的现实障碍。

结论

在工具与理念快速演进的激动人心的时代，我们始终致力于患者照护，但这些工具与理念的价值取决于我们的运用方式。负责任的应用与解读至关重要。此外，鉴于基因组学在使用过程中存在可及性、理解程度及资源差异，其本身便可能造成医疗系统与个体间的差异。因此，作为负责任的诊断者，我们必须持续从患者身上学习，并重新审视自身的假设。

Caballero-Oteyza, Miranda Di Biase, Xiao P Peng. Molecular diagnostics 101: how to use genetic tests in classical hematology.Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2025 Dec 5;2025(1):359-369.Andrés.