摘要

一、tNGS和mNGS的比较

二、tNGS的应用场景和优势

90%以上mNGS阳性检出病原微生物种类不超过200种，而tNGS的检测范围主要针对常见、致病相对明确的100-300种病原微生物，可满足大部分感染性疾病诊疗需求。相较传统病原学检测（如涂片、培养、免疫学、PCR等），tNGS具有更广泛的检测范围和更高的检出率；相对于mNGS，tNGS成本较低，按需开展的同时可结合传统病原学检测，以获取更合理的诊断依据。对于危重症感染患者，传统病原学检测结果均阴性时，tNGS检测则显得非常重要。

共识2 疑似血流感染，建议抗菌药物使用前、抗菌药物疗效差、停用抗菌药物24 h后或下次用药前同步送检tNGS和血培养。

共识3 疑似呼吸系统感染，常规用药效果不佳，3 d内病原学检测阴性或重症感染时，推荐送检tNGS。

共识4 疑似tNGS检测范围内特殊病原体感染（如螺旋体、军团菌、支原体、衣原体、分枝杆菌等）且病情进展快或病程长的患者，免疫抑制、合并基础疾病、反复呼吸系统感染等病情危重者，有临床症状、影像表现或者血清学表现但规范抗感染治疗无效者，推荐送检tNGS。

共识5 疑似罕见或新发病原感染，不在tNGS检测范围内，推荐mNGS检测。无法获得优质样本时，不建议送检mNGS或tNGS。

共识6 疑似泌尿系统感染，推荐优先采用尿培养明确感染的病原体，当尿培养阴性或无法明确病原体时，如果有特殊病原体感染史或暴露因素等，推荐采用靶向PCR；如果无病原体怀疑方向时，推荐送检尿tNGS。

共识7 疑似中枢神经系统感染，若3 d内未明确感染病原体且抗感染经验性治疗无效，推荐送检脑脊液tNGS。

共识8 疑似tNGS检测范围内特殊病原体（隐球菌、脑膜炎双球菌、结核分枝杆菌等）且病势迅疾或迁延感染患者，建议送检tNGS。

共识9 疑似局灶性感染，3 d内常规病原学检测阴性，经验性用药治疗效果不佳，或疑似检测范围内特殊病原体且病势迅疾或迁延者，推荐送检tNGS。

共识10 疑似其他感染，无法明确感染源，或病情持续进展及抗感染治疗无效，推荐送检tNGS。对于复杂感染、多重感染需判断主要病原体，以及明确急、危、重症患者感染源时，建议首选mNGS。

三、样本采集规范

四、实验室检测

共识12 tNGS样本提取前需进行合适的前处理（如黏稠样本的完全消化或液化，以及血液样本的血浆分离等），一般无需去宿主核酸。

共识13 提取样本核酸的质量控制是保障tNGS结果准确的前提。

共识14 文库构建是tNGS的核心内容，直接影响检测灵敏度和特异性，需根据检测目的选择合适的建库路线，并做好质量控制。

共识15 捕获探针或超多重PCR引物，建议至少设计3对或以上；对于致病性或常见感染的病原体，建议设计5对或以上。

共识16 基于探针捕获的tNGS建议数据量在1 000 000（1M）序列以上，基于超多重PCR的tNGS最低数据量建议在100 000（0.1M）序列以上。

共识17 tNGS数据比对范围应包括检测范围内所有病原体和人源基因组，原始数据应去除低质量数据（质量值<20）、短序列数据［（N碱基比例过高的序列（N碱基>5%）］、低质量和接头序列（<36 bp）、舍弃去adapter及质量修剪后长度小于30 bp的序列和低平均质量值序列（平均质量值<30）。

共识18 生信分析输出，数据质控应包括：数据量（总序列数）、测序质量（Q30比例）、内参序列数；物种注释应包括：种/属水平的中文名和拉丁名、原始序列数、归一化序列数、覆盖度（探针捕获法）或扩增子数（超多重PCR法）、阴控数据及各物种批次检出情况。

共识19 检测值低于阳性阈值，不报告；检测值达到或高于阳性阈值，排除实验干扰后报告阳性；无法排除实验干扰应复测或重新采样送检，必要时进行第二种方法学的验证（实时荧光定量PCR等）；无法重新采样或无剩余样本，高致病性病原体需结合临床表现后谨慎考虑是否报告，其他病原体可作为疑似背景（灰区）进行报告，以提供更多信息供临床参考；检出病原体同时存在关联的耐药基因，建议同时报告耐药基因信息。

共识20 不同病原体在不同部位中检出的临床意义不同，建议根据微生物本身的致病性和样本来源，分为致病性微生物、条件致病性微生物及定植或微生态微生物进行分级报告。

五、临床解读

共识21 致病性微生物，建议考虑为病原体。条件致病微生物，建议结合免疫状态、宿主因素、理化指标、影像特征、用药史、治疗效果、传统微生物检测结果等，综合判断是否为病原体。

共识22 定植或微生态微生物，一般不考虑为病原体；如为免疫抑制或与其他微生物检测结果一致或与临床诊断相符，建议作为病原体依据之一。

共识23 耐药基因，建议主要关注临床常见导致耐药的调控基因。革兰阴性杆菌或肠杆菌科，建议关注头孢菌素耐药相关的blaCTX-M、blaSHV、blaTEM等基因；碳青霉烯类耐药相关的blaNDM、blaKPC、blaIMP、blaVIM、blaOXA-23、blaOXA-48、blaOXA-51等基因；甲氧西林耐药相关的mecA等基因，万古霉素耐药相关的vanA、vanB、vanC等基因；大环内酯类耐药相关的核糖体23S rRNA基因突变；结核分枝杆菌一二线用药相关的基因突变及非结核分枝杆菌耐药相关的erm、rrl等基因。

六、质量控制

共识24 实验室人员应根据岗位职责参加不同的培训，包括政策法规、质量管理体系、标准操作规程、性能确认、生物安全、仪器设备的使用和维护、室内质量控制、室间质量评价及其他专业知识，并留存培训记录。

共识25 检测全流程的管理，应制定相应的质量体系文件，及仪器、项目等标准操作流程（standard operating procedure，SOP），形成质量手册，放于固定位置以备随时查阅，指导检测全流程质量控制。

共识26 检验前质量控制，建议包含知情同意书、送检申请单、接收标准、拒收标准、让步检验标准。

共识27 检验中质量控制，建议遵循基因扩增实验室标准要求，合理规划分区并制定详尽的全流程检测SOP及异常情况处理程序。

共识28 检验后质量控制，建议建立结果报告流程，剩余样本保存规定及实验室环境管理规定。

共识29 tNGS检测应对“干实验”及其全流程进行适当的性能确认。

局限性

1、检测范围难以标准化：目前tNGS的检测和报告范围没有统一，各检测试剂设置不同的检测范围，存在重要或常见的病原体漏检的可能。因此，对于不同的感染症候群，有待于形成以临床最关注病原体为核心，并明确规范最低检测范围的行业共识或团体标准，以便提高tNGS检测的临床实用性。

2、低载量病原体的检测偏向性：对于超多重PCR法的tNGS，首先面临的挑战是如何提高扩增反应的能力/效率，以允许在每个PCR周期中有效扩增起始量差别较大的靶标；第二个挑战是在存在大量引物的情况下保持目标扩增特异性。对于探针捕获法的tNGS，同样面临杂交捕获时低载量病原体片段的捕获效率相对偏低的情况。此外，如果采用多样本混合进行杂交捕获，还存在高载量病原样本数据占比较高，低载量病原样本数据量不足，导致灵敏度下降的可能。因此，对低载量病原体应溯源生信分析和结果报告过程，并结合免疫状态、宿主因素、验证指标、影像特征、传统微生物检测结果等临床信息进行综合分析，必要时联系临床开展病例讨论。

3、污染防控：对于超多重PCR法的tNGS，扩增时靶标的模板量可能会放大到上百万倍，同时在文库构建中有开盖的操作，因此扩增产物很容易形成气溶胶而对同批次样本和后续批次样本的检测造成干扰，导致假阳性结果。对于探针捕获法的tNGS，检测环节增加了杂交、洗脱等步骤，导致低序列结果检出时，来源于交叉污染的可能性相对mNGS有所提高。此外，人员操作的不规范也是污染引入的来源之一。因此，针对不同技术路线的特点，实验室需建立确切可行的实验室污染预警和防控体系，建立基于自动化工作站的全自动或半自动实验流程，并做好人员培训和定期考核，有助于污染的防控和污染来源的追溯。