指南共识2024/12/251 次浏览
速览！2024感染性疾病tNGS专家共识发布，mNGS or tNGS？
快速准确的微生物鉴定技术始终是临床微生物关注的焦点，传统微生物检验，诸如形态学、培养、抗原抗体及靶向核酸检测等方法在解决疑难及未知病原微生物上存在局限性。高通量测序（NGS）技术为临床感染性疾病提供了高通量检测技术手段，主要包括宏基因组高通量测序（mNGS）、靶向高通量测序（tNGS）。 宏基因组高通量测序（metagenomics next-generation sequencing，mNGS）…
tNGS病原诊断适应证
临床应充分了解并选用合理设计的tNGS技术，不同类型感染，例如呼吸道感染、中枢神经系统感染等常见病原谱不同，因此tNGS微生物靶标设计应充分考虑感染性疾病症候群的流行病学数据，涵盖该症候群临床常见病原体，不建议纳入某症候群中无临床意义的微生物。目前，tNGS可以作为重要的辅助诊断手段，但不能单独作为确诊或排除的证据。1、tNGS的应用场景应与mNGS有所区别和侧重。对于非重症患者，传统微生物学检测阴性时，考虑送检tNGS；病情危重或新发突发传染病时，考虑送检mNGS。对于有创手段获得的标本，tNGS可作为补充手段，提高病原诊断阳性率。此外，临床高度怀疑感染而传统方法难以获得病原学证据时，或已有病原证据疗效不佳疑似发生混合感染或继发其他感染时，可选用tNGS作补充方法（图1）。tNGS相比PCR方法靶标范围更广。肺部感染的患者中，tNGS相比传统检测方法具有更高的阳性率（96.7%比36.8%）。
2、针对不同的感染部位，建议覆盖相应病原谱的tNGS，比如肺部感染组套、中枢神经系统感染组套等。靶向病原谱应包括该症候群难培养、罕见的病原，不宜纳入该部位无临床意义的微生物。
3、tNGS结果阴性而临床仍高度怀疑感染时，考虑送检mNGS。
4、建议根据临床需求和医疗花费选择不同tNGS方法。多重PCR扩增tNGS方法靶标少，花费较低，而探针捕获tNGS方法覆盖病原谱广，花费较高。
5、临床高度怀疑结核分枝杆菌感染或抗酸染色阳性需鉴别非结核分枝杆菌（NTM）感染时，考虑选用包括结核分枝杆菌复合群及致病性NTM的tNGS。在鉴别诊断方面，利用tNGS方法及时鉴别结核与其他病原体感染，对于结核病患者的早期发现和分诊具有重要的临床和流行病学意义。tNGS有助于从（亚）种或复合群水平区分结核分枝杆菌和NTM。一项纳入370株分离株、73个种/复合群的研究显示，tNGS与基于表型、rpoB和（或）16S rDNA一代测序的复合参比方法相比，292株结果在（亚）种或复合群水平完全一致。在10^3、10^2和10^1基因组拷贝的梯度稀释条件下，tNGS成功鉴定结核分枝杆菌的比例分别为16/16、13/16和0/16，成功鉴定胞内分枝杆菌的比例为3/3、3/3和2/3 。6、阴性结果临床判读和决策阴性结果不建议单独作为排除依据，应结合tNGS的靶标覆盖范围、标本类型和其他临床辅助检查进行综合判断。假阴性结果常见于：（1）设计问题导致：tNGS靶标未覆盖该微生物；（2）湿实验技术问题导致：破壁困难导致核酸未彻底释放、微生物含量过低、标本采样不规范、存储或运输不当等；（3）干实验问题导致：微生物序列的不完整性、比对数据库未纳入等。经临床判读后仍高度怀疑感染性疾病，应及时确认tNGS靶标覆盖范围、查看tNGS原始检出病原列表。可在经验性治疗的同时完善其他检查，必要时重复采样、或送检不同部位标本、或更换其他NGS方案进行复测（图1）。耐药基因检测
mNGS常规数据量对耐药基因检测存在局限性，随机测序的方案仅在高浓度时可稳定检出耐药基因，尤其对于水解酶等耐药机制，mNGS的读长和测序深度难以分析亚型，因此不建议mNGS常规用于耐药基因检测。而tNGS检测的靶标相对确定，可将水解酶亚型特定区段作为富集靶标，且相比mNGS的耐药基因检测限更低。使用临床标本进行tNGS耐药基因检测能获得相对更可靠的耐药结果。1、结核分枝杆菌培养和药敏试验时间长，建议tNGS用于呼吸道标本的结核分枝杆菌鉴定、耐药基因及其突变位点的检测。2024年，WHO推荐tNGS用于结核分枝杆菌分子药敏检测。经细菌学确诊的肺结核患者，可在呼吸道标本（痰液、BALF等）中使用tNGS技术检测利福平、异烟肼、乙胺丁醇、吡嗪酰胺和氟喹诺酮类的耐药性；相关药物的耐药基因靶点应至少包括第一级耐药基因（如rpoB、inhA、katG、embA、embB、pncA、gyrA、gyrB等），可参考WHO指南推荐。经细菌学确诊的利福平耐药肺结核患者，可在呼吸道标本（痰液、BALF等）中使用tNGS技术检测异烟肼、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、氟喹诺酮类、贝达喹啉、利奈唑胺、氯法齐明、阿米卡星和链霉素的耐药性。此外，当患者体内存在异质性耐药时，研究发现tNGS技术通过扩增靶标基因可量化所有结核分枝杆菌中的少量耐药菌。而在耐药菌占比少的情况下，基于扩增曲线的PCR技术难以报出耐药性，且其涵盖耐药靶点有限，导致假敏感。因此tNGS的使用对于早期识别潜在耐药结核、预警临床抗结核治疗失败至关重要。但应注意，tNGS的耐药检出能力和标本中细菌载量相关。2、临床怀疑特定耐药菌感染，并且耐药基因与耐药表型关联性强时，可考虑送检tNGS，作为常规方法的补充。重点关注碳青霉烯酶、超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、万古霉素耐药肠球菌（VRE）等耐药基因和病原体。美国临床和实验室标准协会（CLSI）M100文件推荐部分微生物中对以下位点可进行分子检测，但tNGS需要积累更多证据，且应尽可能明确耐药基因和病原微生物的对应关系。临床重要的耐药基因包括碳青霉烯酶基因（bla KPC、bla OXA-48、bla VIM、bla NDM、bla IMP等）、MRSA耐药基因（mecA、mecC）、VRE耐药基因（vanA、vanB等）、ESBLs（bla CTX-M、bla SHV、bla TEM等）。对于基因亚型可导致不同药敏谱的基因，例如检测bla TEM需要能够区分广谱β-内酰胺酶和ESBLs，检测bla KPC需要区分普通型（对碳青霉烯耐药，头孢他啶-阿维巴坦敏感）和酶抑制剂耐药型（对头孢他啶-阿维巴坦耐药）等，建议选用可区分酶亚型的tNGS方案。一项小样本量研究发现tNGS耐药结果和表型药敏在部分标本中一致，但实际临床应用尚需更多医学证据的积累和探索。3、耐药基因判读建议结合相对应的病原微生物均一化序列数、耐药机制、tNGS的探针/引物设计靶标范围综合解读耐药基因检测结果。（1）对于结核分枝杆菌耐药检测，耐药结果显示阳性可作为耐药或异质性耐药参考依据，但耐药结果显示阴性应考虑结核分枝杆菌的载量，评判是否因检测序列数过少导致的假敏感，并参考其他分子或表型药敏结果。（2）对于其他细菌耐药结果，应考虑耐药机制，例如检测到耐药基因并不能直接确定该基因是否表达，无法得出药敏表型；需要区分亚型的水解酶等耐药机制，需要参考序列数和覆盖度等指标进行置信度评估。参考文献
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