摘要

方法：对4例成年期癫痫发作且疑似病因不明的脑炎患者血清样本进行表位鉴定，这些样本在自身抗体筛查中结果一致。本研究综合运用多种检测手段，包括免疫印迹、免疫沉淀、质谱分析、原代神经元培养中的亚细胞结合模式分析、野生型与Drebrin基因敲除小鼠脑组织的免疫组化技术，抗体暴露实验对突触形成障碍、形态异常及神经元兴奋性异常的体外分析。

结果：在一例成年期癫痫发作且疑似脑炎的患者血清中，免疫印迹检测发现70kDa处存在强信号，质谱分析显示Drebrin可能是潜在抗原。另有三例患者的血清在免疫印迹检测中也显示出约70kDa的强免疫反应性，同样呈抗Drebrin抗体阳性。抗Drebrin抗体血清阳性患者出现癫痫发作、记忆障碍及脑脊液蛋白含量升高。脑部磁共振成像显示杏仁核-海马区T2加权信号增强及海马硬化。一例抗Drebrin抗体血清阳性患者活检证实为T淋巴细胞脑炎。当原代海马神经元暴露于抗Drebrin抗体时，突触结构异常、形态改变和神经元兴奋性异常升高。

结论：抗Drebrin抗体可定义一种以复发性癫痫、神经精神障碍以及边缘系统偶尔累及皮质结构的炎症为特征的慢性综合征。该疾病应考虑采用免疫抑制治疗。

在此，我们报告4例患者的临床和免疫学特征，这些患者表现出神经精神症状和癫痫发作，提示存在自身免疫性脑炎/边缘性脑炎，且其体内存在针对一种迄今未被识别的抗原Drebrin（大脑发育调节脑蛋白）的抗体。补充的体外分析表明，患者来源的抗Drebrin抗体可导致突触结构异常及神经网络过度兴奋。

方法

对4例成年期癫痫发作且疑似病因不明的脑炎患者血清样本进行表位鉴定，这些样本在自身抗体筛查中结果一致。本研究综合运用多种检测手段，包括免疫印迹、免疫沉淀、质谱分析、原代神经元培养中的亚细胞结合模式分析、野生型与Drebrin基因敲除小鼠脑组织的免疫组化技术，抗体暴露实验对突触形成障碍、形态异常及神经元兴奋性异常的体外分析。

结果

所有4 例抗Drebrin 抗体检测呈阳性的患者（抗Drebrin 抗体阳性；1名男性，3名女性；发病年龄45岁，范围23-68岁）均发展为亚急性进行性脑病，主要症状包括神经精神障碍（涉及抑郁和认知障碍），以及/或者确诊或临床疑似的局灶性癫痫发作或癫痫持续状态（表1）。脑脊液改变包括所有患者的蛋白水平升高，以及至少1例患者出现单核细胞增多。T2加权图像中的脑MRI改变包括海马体积动态变化以及海马萎缩（患者#2 的代表性脑磁共振成像见图1A-D）。

基于患者血清/脑脊液中的抗Drebrin抗体，我们通过五组实验验证了该抗体的靶向特性。具体包括：(1)使用患者血清中含有的抗体，从脑组织/突触小体裂解液中进行Drebrin免疫沉淀（图2）；(2)采用市售抗Drebrin抗体检测与患者血清相同的免疫印迹条带模式（图2）；(3)对比市售抗Drebrin抗体在患者血清与对照组的树突棘中的结合模式，发现抗体靶标在树突棘中显著富集（图2）；(4)鉴定出两个可作为抗体识别表位的Drebrin蛋白结构域（图2）；(5)通过野生型（WT）与Drebrin基因敲除（KO）小鼠的免疫组化比较分析，发现敲除小鼠脑组织中患者血清未呈现免疫反应性（图5）。此外，我们的体外实验数据表明，患者来源的抗Drebrin抗体具有直接致病作用：其通过与突触后Drebrin结合，导致突触后Drebrin丰度与分布异常（图3），并引发神经网络过度兴奋（图4）。

图1  抗Drebrin自身抗体阳性患者代表性脑部磁共振成像（cMRI）

（A-D）cMRI扫描结果（T2-FLAIR）显示病变范围从细微到广泛不等，不仅累及边缘系统结构，还波及皮质区域。患者#2的cMRI表现为：(A)右侧杏仁核区出现肿胀及T2加权高信号（白色箭头），以及(B)右侧海马内部纹理纹理存在一定程度的缺失（白色箭头）。(C)与这些局限性边缘系统改变形成对比的是，患者#4的cMRI显示左侧半球广泛萎缩（白色箭头）及左侧杏仁核部分肿胀。(D)左侧海马出现轻微体积减小（白色箭头）。

图2  新型抗Drebrin抗体的鉴定及靶表位定位

（A）通过免疫印迹法对人、大鼠、小鼠及突触小体匀浆样本进行检测，结果显示70kDa处有强免疫反应信号（*）。

（B）免疫印迹筛选 阴性对照组 和 患者#1血清进行免疫沉淀后，SDS-PAGE凝胶电泳显示70 kDa处存在强信号（*），该信号仅存在于患者样本中，经质谱分析鉴定为Drebrin。

（C）从细菌中纯化的人源Drebrin蛋白经考马斯亮蓝染色显示：由于该蛋白含有大量带负电荷的残基，实际检测到的条带尺寸与理论分子量存在差异。

（D）本研究纳入的4例患者血清样本对纯化人源Drebrin蛋白（如考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE图所示）表现出反应性，同时针对纯化蛋白中His标签的抗体也显示出相同反应特征。

（E）指示患者#1的原代海马神经元培养物中人源抗Drebrin抗体与小鼠单克隆抗Drebrin抗体的代表性免疫标记对比。两者均呈现相似的神经纤维层表达模式，且在树突棘上均显示出强免疫反应性，表明二者结合的是同一靶蛋白Drebrin。

（F）全长Drebrin蛋白结构示意图，展示其功能域、外显子结构及被鉴定为抗体结合靶点的第1至6号重叠片段。

（G）4 例患者血清与全长 Drebrin 及其片段 1-6 的代表性免疫印迹。考马斯亮蓝染色显示用于免疫印迹的纯化蛋白上样量。MW = 分子量；Pat.= 患者。

图3  人类抗Drebrin抗体的摄取改变突触后Drebrin的丰度与分布

（A）抗Drebrin抗体阳性患者的血清及小鼠单克隆抗Drebrin抗体强烈标记了富含Drebrin的树突棘。

（B）通过与突触后蛋白PSD95及Homer抗体共染色显示，两者在树突棘处呈现显著共定位，表明Drebrin存在于兴奋性突触后区域。

（C-E）所有抗Drebrin抗体阳性患者的血清中均观察到相似程度的共标记现象：(C) Drebrin、(D) Homer或(E) PSD95。

（F）用不同浓度的商用抗Drebrin 抗体或对照 IgG 孵育原代海马神经元的代表性染色。在体外第 14 天，于 37℃下孵育 48 小时，高浓度抗 Drebrin 抗体或对照 IgG（左图；20μg/ml）或低浓度（右图；2μg/ml）时，高浓度抗 Drebrin 抗体可被细胞内摄取。采用DAPI复染（蓝色）进行观察。

（G）使用患者#1纯化IgG、对照IgG孵育的原代海马神经元突触形态分析代表性图像。结果显示，使用患者1纯化IgG孵育20分钟，48小时后，突触体积增大且荧光强度增强（Kolmogorov-Smirnov检验：****p < 0.0001，两种参数及时间点均显著）。

图4  培养海马神经元神经网络活动增强

（A）与正常人血清（NHS）及未处理神经元（Native）相比，抗Drebrin抗体阳性血清导致神经元活动增强。

（B）展示了经正常人血清（NHS）孵育的神经元及经抗Drebrin抗体阳性血清处理的神经元的峰电位和爆发活动。

（C）抗Drebrin抗体阳性血清孵育导致神经元神经网络活动增强。

图5  通过脑组织切片比较Drebrin基因敲除（KO）小鼠与野生型（WT）小鼠的血清反应性

（A1-4）抗Drebrin抗体阳性患者#1-4血清及A6小鼠单克隆抗Drebrin抗体在野生型小鼠海马结构中显示出强烈反应。

（B1-4）相比之下，在使用Drebrin基因敲除（KO）小鼠海马组织切片的平行实验中，未检测到任何结合模式。（B6）市售小鼠单克隆抗Drebrin抗体同样未显示染色信号。

（C1-4）野生型（WT）小鼠小脑分子层的典型结合模式。

（D1-4）Drebrin基因敲除（KO）小鼠中完全消失

（C6、D6）小鼠单克隆抗Drebrin抗体的观察结果与上述一致。

（A5、B5、C5、D5）使用正常人血清作为阴性对照时，未见任何染色信号。

用抗Drebrin抗体阳性患者血清孵育的野生型小鼠海马和小脑分子层中可见细微的神经毡结合模式，这与小鼠单克隆抗Drebrin抗体的模式高度一致（所有比例尺= 500μm）。

结论

抗大脑发育调节脑蛋白（Drebrin）抗体可定义一种以复发性癫痫、神经精神障碍以及边缘系统偶尔累及皮质结构的炎症为特征的慢性综合征。该疾病应考虑采用免疫抑制治疗。本研究的一个有趣启示是，对于疑似脑炎且出现神经心理功能障碍和/或癫痫活动，并伴有抗Drebrin抗体的患者，免疫抑制剂治疗可能成为一种可行选择。尽管该病症的发病率目前尚未明确，但我们预计通过定期对疑似（边缘）脑炎的患者进行血清学检测，未来将发现更多病例。

参考文献

Pitsch J, Kamalizade D, Braun A, et al. Drebrin Autoantibodies in Patients with Seizures and Suspected Encephalitis. Ann Neurol. 2020 Jun;87(6):869-884. doi:10.1002/ana.25720.