抗AGO抗体|自身免疫性神经系统疾病的生物标志物

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针对神经胶质抗原的自身抗体的发现彻底改变了对自身免疫性神经疾病的诊断和理解，并导致了对自身免疫性脑炎、副肿瘤综合征和炎症性周围神经病变的不同临床描述。一方面，一些神经元抗体可以在病理生理学中直接发挥直接作用，主要是当它们直接针对表面抗原，如NMDAR、NF155或者CNTN1。另一方面，一些抗体只是提示潜在的癌症，可以用于副肿瘤综合征的肿瘤筛查，而其他抗体是自身免疫疾病的生物标志物，如感觉神经病（SNN）中针对FGFR3的抗体。然而，仍有许多患者和疾病在临床上与特征明显的自身免疫性神经系统疾病难以区分，但没有可靠的生物标志物。在这些病例中，总是很难确定该疾病的自身免疫性，只是由脑脊液中偶尔的炎症异常所支持。因此，发现新的抗体对于确定这些疾病的自身免疫性起源和提出一种可能带来更好预后的免疫调节剂治疗具有重要意义。
在本研究中，使用两种不同的方法（免疫沉淀结合质谱分析的蛋白质组学和蛋白微阵列）来识别新的抗体靶点，从而发现针对Argonaute蛋白家族的抗体（AGO-Abs），其已经在系统性自身免疫性疾病中被报道。

方法

患者的血清和脑脊液均取自神经生物样本库，我们选择了疑似AE/PNS患者的250例脑脊液样本和42例周围神经病变患者的血清样本。作为对照，我们选择了各种伴有或没有神经系统受累患者的312例脑脊液和544例血清（表1）。所有样本均采集于2007年10月至2019年12月。

结果

神经系统疾病自身抗体靶点Argonaute蛋白的鉴定

用两种不同的方法鉴定了Argonaute蛋白为抗体的靶点。首先，在一系列疑似AE/PNS患者的CSF样本中，一个样本（来自患者XI）在海马神经元的细胞质中显示非典型免疫染色（齿状回颗粒层和CA1，CA3锥体细胞），小脑（颗粒层，一些在分子层），和大脑皮层（图1A）。使用大鼠全脑组织匀浆进行的免疫印迹显示，患者XI的脑脊液显示没有信号（数据未显示），这表明抗体是构象型的。用患者XI或对照组脑脊液对大鼠全脑组织匀浆进行免疫共沉淀，发现在100kDa和280kDa（图1B）时存在特异性条带。随后，基于质谱分析的蛋白质组学确定了AGO1、AGO2、AGO3和AGO4（理论~100kDa）。同时，用蛋白微阵列对12例SNN患者和34例对照组的血清进行筛选，发现3例SNN患者血清明显靶向AGO1和AGO2蛋白；对照组血清均未靶向任何AGO蛋白。4例SNN患者靶向AGO3蛋白和1例AGO4蛋白，但反应性较低（图1C）。

抗AGO抗体的特异性为了验证抗AGO抗体的特异性，我们构建了不同的CBA，每个抗体都有一个AGO质粒。患者XI的脑脊液与AGO 1-4的转染细胞发生反应，而对照组的脑脊液没有反应性（图2，第1-4行），TNRC6转染细胞（图2，第5行）和未转染的细胞（第6行）没有观察到信号。

此外，在同时消耗抗AGO1抗体和抗AGO2抗体后，患者XI的脑脊液在大鼠脑组织切片上的间接免疫荧光反应消失。证实了先前观察到的非典型染色模式仅是由针对AGO蛋白的抗体引起的。

AGO-Ab神经系统患者的临床特征共鉴别21例患者伴有抗AGO抗体和神经系统症状，其中位年龄为57岁（范围25-85岁），15/21（71.4%）为女性（表2）。最常见的临床表现为感觉神经病SMN（8/21，38.1%），其次是边缘性脑炎LE（6/21，28.6%）、小脑综合征（2/21，9.5%）、其他周围神经病变（2/21，9.5%）、菱形脑炎（1/21，4.8%）和眼阵挛-肌阵挛综合征(1/21,，4.8%)。8/16（50.0%）患者脑脊液为炎症性（淋巴细胞增多≥5细胞），4/9（44.4%）患者寡克隆区带阳性。除1例中枢神经系统受累的患者外，所有患者的MRI均有异常（图3）。只有5/21（23.8%）患者被诊断为癌症。自身免疫性疾病共病（7/21患者为干燥综合征，33.3%）和/或共存抗体（主要是抗干燥综合征综合征相关抗原A，8/21，38.1%）可见于14/21（66.7%）患者；而其余7例（7/21，33.3%）中抗AGO抗体是自身免疫性疾病的唯一生物标志物。共有14/21（66.7%）患者接受了免疫治疗，包括类固醇（n = 11）、静脉注射免疫球蛋白（n = 9）、环磷酰胺（n = 3）、利妥昔单抗（n = 3）、血浆交换（n = 2）、硫唑嘌呤（n = 2）和/或甲氨蝶呤（n = 2）。19例有相关临床资料的患者发病时的mRS评分中位数为3（范围2-5），16例患者最后一次随访时的中位mRS评分为2.5（范围0-6），5例患者未进行随访。在接受免疫治疗的患者中，有足够的随访数据（n = 13），8/13（61.5%）改善（最后一次随访时的mRS评分低于发病时），3/13（23.1%）保持稳定（mRS评分不变），2/13（15.4%）的病情恶化。总共有2例（2/21，9.5%）患者死亡：患者XIV，由于SCLC的进展，以及患者XVI，由于酒精性肝硬化的并发症。

抗AGO抗体的特性

在到目前为止测试的所有样本中，抗AGO抗体阳性的样本在CBA上反应上，AGO1和AGO2-Ab比AGO3和AGO4-Ab反应更强烈。抗AGO抗体的血清中位滴度为40000（范围[200-2560000]），高于脑脊液中位滴度(400；范围[10-512000]）。AGO1和AGO2- Ab脑脊液和血清中位数滴度均高于AGO3和AGO4-Ab的滴度（数据未显示）。这些结果，以及来自蛋白微阵列和AGO1/AGO2免疫吸附的结果表明，被研究患者的抗体主要针对AGO1和AGO2，而不是AGO3和AGO4。在分析的8例患者中，脑脊液中的AGO1/2-抗体主要是免疫球蛋白G（IgG）1亚类，但在4例患者中也存在其他亚类；在血清中，IgG1也是11/12例患者的主要亚类（其余的一个为IgG3），但其他亚类在6例患者中同时出现。AGO-Ab无法通过CBA识别AGO的4个亚基，因为转染任何一个亚基都取消了反应性，而全长的AGO阳性对照是有反应性的（数据未显示）。

总之，我们在此报道了抗AGO抗体作为自身免疫性神经系统疾病的潜在生物标志物，特别是在伴有相关系统性疾病的患者中。在少数患者中，抗AGO抗体可能是自身免疫性神经系统疾病的唯一生物标志物。参考文献
Do LD, et al. Argonaute Autoantibodies as Biomarkers in Autoimmune Neurologic Diseases. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 2021 Jul 28;8(5):e1032.

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HongWang

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抗AGO抗体|自身免疫性神经系统疾病的生物标志物

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