近日，杭州宏望医学检验实验室有限公司喜 获国家发明专利授权 ！专利名称：一种基于细胞法检测重症肌无力RYR1抗体的抗原及其应用，专利号：ZL 2025 1 1626178.1，授权公告号：CN 121064313 B。 该专利技术属于生物技术中的免疫检测领域，所述主要抗原通过将RYR1基因中特定功能域（SPRY1和/或SPRY3）的截断序列设计得到，克服了完整RYR1基因长序列表达的困难，同时又保…

近日，杭州宏望医学检验实验室有限公司喜获国家发明专利授权！专利名称：一种基于细胞法检测重症肌无力RYR1抗体的抗原及其应用，专利号：ZL 2025 1 1626178.1，授权公告号：CN 121064313 B。
该专利技术属于生物技术中的免疫检测领域，所述主要抗原通过将RYR1基因中特定功能域（SPRY1和/或SPRY3）的截断序列设计得到，克服了完整RYR1基因长序列表达的困难，同时又保留RYR1结构和抗原表位，可作为重症肌无力胸腺瘤相关自身抗体的特异性识别靶点，其中SPRY1表现出更优的抗原性，且双质粒混合策略可增强检测信号，可为后续自身抗体检测方法的建立提供实验依据。
这一成果不仅是国家知识产权局对宏望医学研发实力与创新能力的权威认可，更是公司在神经免疫检测领域取得的关键技术突破，为重症肌无力胸腺瘤相关自身抗体检测提供了高效、可靠的全新解决方案！

背景技术

重症肌无力（myasthenia gravis，MG）是获得性神经‑肌肉接头传递障碍的自身免疫性疾病。乙酰胆碱受体（acetylcholine receptor，AChR）抗体是最常见的致病性抗体，此外，针对突触后膜其他组分，包括肌肉特异性酪氨酸激酶受体（muscle specific  tyrosine kinase，MuSK）、脂蛋白受体相关蛋白4（lipoprotein receptor‑related protein 4，LRP4）等抗体均可干扰 AChR 聚集、影响AChR的功能及神经‑肌肉接头信号传递，参与MG的发生发展。连接素抗体和兰尼碱受体（ryanodine receptor，RyR）抗体是针对骨骼肌细胞成分的抗体。连接素抗体和RyR抗体通常见于合并胸腺瘤或晚发型MG。此外，两种抗体可能与更严重的疾病程度相关。哺乳动物共有三种RYR（RYR1，RYR2和RYR3），其中RYR1主要是骨骼肌中表达，RYR2和RYR3分别主要在心肌和大脑中发现，因此RYR1是重症肌无力患者优选的检测靶点。RYR1基因由15000多个核苷酸组成，编码564 kDa的蛋白。鉴于RYR1巨大的蛋白结构，如何较好的表达RYR1全序列蛋白作为检测底物存在巨大的挑战。基于之前的文献报道，RYR1的抗原表位分布较为广泛。Takamori等的检测结果显示RYR1的C端4997-5017氨基酸残基是其主要的抗原表位，而N端的1191-1216是非主要抗原表位。而Mygland等的研究结果显示，心肌细胞C端的4929-4949氨基酸残基是其主要的抗原表位。相反，Skeie等的研究结果显示，RYR1的抗原表位主要是N端的799-1172和2591-2939氨基酸残基。根据文献报道，RYR1蛋白结构可以分为NTD结构域，SPRY结构域，Handle结构域，HD结构域，Central结构域和Channel结构域。基于Takamori、Mygland和Skeie的研究，显然，RYR的重要抗原表位可能存在于SPRY结构域，HD结构域和Channel结构域，但具体的RYR1自身抗原片段仍不清楚，因此，RYR1筛选和明确有效的RYR1自身免疫抗原片段显得十分迫切。 另外，现有的RYR1抗检测方法包括酶联免疫吸附测定法（Elisa）和蛋白印迹法（WB）。然而，上述两种方法学都是需要进行RYR1抗原的提取，该过程可能导致抗原构象发生改变，进而影响检测结果。例如Skeie等的研究结果显示，骨骼肌肌质网膜蛋白粗提物的WB检测使部分RYR1阳性样本失去免疫反应。此外，酶联免疫吸附测定法和蛋白印迹法的蛋白原料来源于动物骨骼肌细胞，蛋白的分离纯化也存在相当的挑战。 相比之下，基于细胞底物的实验（Cell based assay，CBA）法能令RYR1以天然、高簇集的状态表达，极大限度地保持其真实构象，因此，开发一种基于细胞底物的RYR1自身抗体检测方法是十分必要的，该方法不仅能揭示RYR1自身抗体的抗原表位分布，而且能提高RYR1自身抗体的检测灵敏度和特异性。 中国专利CN116143897B报道了两种能用于检测抗RyR1自身抗体的有效抗原：MGTR1和MGTR 2，MGTR1为RyR1 N端和中间部分序列拼接而成的融合蛋白，MGTR 2为RyR1 N端、中间和C末端的部分序列拼接而成的融合蛋白，通过将带有MGTR1和MGTR2基因的表达质粒转染细胞系制备成以细胞为载体的检测材料，能够适用于CBA法在有胸腺瘤MG患者中高效地检测出抗RyR1抗体，阳性检出率达到50%。

与现有技术相比，本发明优点及有益效果

（1）本发明首次筛选出基于RYR1功能域的新型抗原片段，该抗原片段通过SPRY1和/或SPRY3的截短序列构建设计而成，极大地减小了蛋白分子量，克服了全长RYR1蛋白过大体外表达困难的问题。

（2）本发明的抗原片段能够最大限度的保留RYR1抗原结构及其抗原表位的正确性，从而极大地提高捕获患者血清中RYR1自身抗体的概率和检测灵敏度，相较于使用单一较小的线性肽段，更能模拟天然构象表位，有效避免因表位选择偏差而导致的漏检风险。（3）本发明通过将抗原编码基因转染至HEK-293等细胞中，能够获得高水平的抗原表达细胞，这些细胞保留了天然构象表位，可直接作为基于细胞法的检测（CBA）的检测试剂，用于重症肌无力（MG）的诊断，为RYR1自身抗体检测提供了高效、可靠的检测方案。（4）本发明可为免疫印迹等检测提供了标准化抗原（从过表达该抗原的细胞中纯化出的重组蛋白，具有高纯度和高免疫反应性，以此作为标准化抗原），可广泛应用于蛋白印迹（如Western Blot）、斑点印迹（Dot Blot）等线性表位检测平台，克服了从天然组织中提取RYR1蛋白的繁琐流程、产量低及批次间差异大的缺点，实现了检测试剂的标准化和高通量生产。附图说明图1，在正常人血清检测过程中，SPRY1、SPRY2、SPRY3、HD1、HD2、HD3、HD4、Channel功能域截断体均不能检测到绿色荧光，表明正常人体内不含RYR1的自身抗体。图2，低RYR滴度（1:32）的胸腺瘤患者的血清检测结果显示，SPRY1截断体可以检测到明显的绿色荧光，而SPRY3截断体出现微弱的绿色荧光信号，其余截断体均不能检测到绿色荧光。该结果表明SPRY1和SPRY3截断体上具有抗原表位，且SPRY1的抗原表位数量和对抗体的亲和性高于SPRY3。图3，高RYR滴度（1:320）的胸腺瘤患者血清检测结果显示，SPRY1截断体可以检测到非常强烈的绿色荧光，而SPRY3截断体出现微弱的绿色荧光信号，其余截断体均不能检测到绿色荧光。该结果进一步表明SPRY1和SPRY3截断体上具有抗原表位，且SPRY1较SPRY3而言具有更高的抗原性和亲和性，是较好的用于检测的片段。图4，滴度在1:32的胸腺瘤患者的血清检测结果显示，SPRY1、SPRY3双质粒等比例混合的转染细胞系可以检测到较单SPRY1或者单SPRY3更为强烈的绿色荧光，提示两者可能存在协同效应，可提高检测灵敏度。
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